轉(zhuǎn)錄終止子對麥芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中表達的影響

樓志華

（江蘇省奧谷生物科技有限公司，江蘇溧陽 213300）

隨著細菌的研究深入到分子遺傳層面，細菌RNA聚合酶（RNAP）終止轉(zhuǎn)錄的機制一直是基因表達研究的重點。在基因表達的調(diào)節(jié)中，對轉(zhuǎn)錄終止過程的調(diào)節(jié)是最重要的環(huán)節(jié)之一[1-2]。轉(zhuǎn)錄終止的分子基礎(chǔ)是DNA和蛋白質(zhì)的相互作用，RNA轉(zhuǎn)錄物中形成的特定結(jié)構(gòu)會使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物不穩(wěn)定，目前將這樣造成的轉(zhuǎn)錄終止歸納為兩種機制：內(nèi)在型和因子依賴型[3]。因此，轉(zhuǎn)錄終止子是和啟動子同樣重要的表達元件。目前，對于啟動子鑒定及改造的研究已廣泛開展，而對轉(zhuǎn)錄終止子的認識有限。現(xiàn)有對細菌轉(zhuǎn)錄終止子的認識主要來源于對大腸桿菌的研究。芽孢桿菌作為重要的工業(yè)微生物，雖然在生產(chǎn)中已被廣泛使用，但其分子遺傳仍處于起步階段[4-5]。尤其是在轉(zhuǎn)錄終止元件的鑒定方面，目前還鮮有報道。本研究基于地衣芽孢桿菌基因組信息，預(yù)測并鑒定了不同的轉(zhuǎn)錄終止子。進一步通過考察不同終止子對淀粉酶報告基因表達的影響對其特性進行了評價。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

實驗中用到的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600、大腸桿菌Escherichia coli JM109均為本實驗室所保藏。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基均依照文獻配置[1]，重組大腸桿菌培養(yǎng)基中添加100 μg/mL氨芐青霉素，重組芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中添加20 μg/mL四環(huán)素，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基依照文獻配置[2]。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶，美國Fermentas公司；T4DNA連接酶、Ex taq DNA連接酶，大連Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒、核苷酸片段純化試劑盒、膠回收試劑盒，Axygen公司；氨芐青霉素、四環(huán)素，生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨，OXOID（美國）公司；其他常用試劑藥品均來自于國藥集團（上海）有限公司。

UV2000紫外可見分光光度計，美國UNICO公司；HB-100恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精密實驗設(shè)備有限公司；Delta 320型pH計，瑞士Mettler-Toledo 公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國沃特斯公司。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴增獲得連接六種轉(zhuǎn)錄終止子的目的片段，載體為pHY300并用NruI單酶切。連接體系（20 μL）為：目的片段 14 μL，載體2 μL，T4連接酶 2 μL，Buffer 2 μL。放置16 ℃金屬浴中連接16 h，獲得T1～T6六種重組質(zhì)粒。

1.4 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及篩選

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備方法及篩選方法參照文獻進行[3]。

1.5 重組海藻糖合成酶的誘導(dǎo)表達

將重組枯草芽孢桿菌接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，以此作為種子液。過夜培養(yǎng)的種子液以3%（V/V）的接種量接種于30 mL TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)8 h后，加入終濃度為1.0%（w/w）的30%木糖，于30 ℃、250 r/min的條件下誘導(dǎo)發(fā)酵16 h。對于胞內(nèi)表達麥芽糖淀粉酶的重組菌，將發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃條件下冷凍離心收集菌體，收集上清液，上清液即為粗酶液。麥芽糖淀粉酶活力的檢測參照文獻進行[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中分別預(yù)測得到6種芽孢桿菌來源的不同轉(zhuǎn)錄終止子序列，如表1所示。將構(gòu)建的質(zhì)粒pHY300用NruI單酶切得到載體，構(gòu)建的質(zhì)粒pHY-BLMA分別用6種終止子PCR擴增得到目的片段，將PCR產(chǎn)物純化后與載體連接得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coliJM109，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證。驗證正確的轉(zhuǎn)化子接種于液體LB培養(yǎng)基后提取質(zhì)粒，得到了可以表達淀粉酶基因的重組質(zhì)粒。圖1為PCR擴增后得到的目的片段的電泳驗證圖，目的片段大小約為2 000 bp。圖2為重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coliJM109中，對長出的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR鑒定的電泳驗證圖。

表1 轉(zhuǎn)錄終止子的預(yù)測

圖1 終止子PCR電泳圖

圖2 菌落PCR電泳圖

2.2 重組表達質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中的表達

以野生菌為對照，測定野生菌、原始菌以及重組菌的菌體量、蛋白濃度、粗酶液的酶活，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2中的重組菌株的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)野生菌沒有酶活，而原始菌以及重組菌均有酶活，說明在原始菌及重組菌內(nèi)都有淀粉酶的表達。發(fā)酵24 h后野生菌的菌體量最多，而重組菌的菌體量相對于原始菌的較少，但重組菌的蛋白濃度有所提高，酶活有小幅度的增加，單位菌體量上的酶活有較大的提高。由于酶活提高的程度不大而蛋白濃度又有增加，使得單位蛋白的酶活有所降低。重組菌中，生長最好的菌株是B.subtilis WB600（T1）；蛋白濃度最高的是B. subtilis WB600（T6），最高達到0.885 g/L；酶活力最大的是B. subtilis WB600（T5），最高達到 161.49 U/mL；單位菌體酶活最高的是B. subtilis WB600（T5），可達到22.24 U/mL；單位蛋白酶活最高的是B. subtilis WB600（T4），最高達到306.71 U/mL。

表2 重組菌的表達

3 結(jié)論

從NCBI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測了芽孢桿菌來源的6個不同的轉(zhuǎn)錄終止子，以淀粉酶為報告基因，考察他們對目的基因表達的影響。結(jié)果顯示，所預(yù)測的6個基因均可以介導(dǎo)目的基因的功能表達，表明他們具有應(yīng)用為新的表達元件的潛力。