陳珠金

[安邦（廈門）生物科技有限公司，福建廈門 361000]

鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）是一種分子量為48 000的糖蛋白，是從子宮頸鱗狀細胞組織中分離出來的，屬于腫瘤相關抗原TA-4的亞段，存在于鱗狀細胞癌的胞漿內，是一種特異性很好并最早用于診斷鱗癌的腫瘤標志物。SCC-Ag最初從宮頸癌組織中分離獲得，就生物活性而言屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，包括SCC 1和SCC 2兩個基因。SCC-Ag廣泛存在于不同器官的正常組織中（含量極微）和惡性病變的上皮細胞中，在血清中至少有4種形式的SCCAg：游離SCC1、游離SCC2以及與之相對應的絲氨酸蛋白酶結合物。SCC-Ag在正常的鱗狀上皮細胞中抑制細胞凋亡和參與鱗狀上皮層的分化，在腫瘤細胞中參與腫瘤的生長，有助于所有鱗狀上皮細胞起源癌的診斷和監測，如子宮頸癌、肺癌（非小細胞肺癌）、頭頸部癌、食管癌以及外陰部鱗狀細胞癌等[1]。

血清鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）的常用測定方法有放射免疫分析、酶聯免疫分析、免疫比色法和化學發光法，其中化學發光法檢測SCC-Ag能做到定量檢測，其量值水平高低與腫瘤的進展程度相關，可作為愈后及提示復發的指標[2]。本文研制的試劑以羧基修飾的磁性微球偶聯SCC-抗體1（SCC-Ab1），利用吖啶磺酰胺標記SCC-抗體2（SCC Ab2），采用雙抗體夾心法，形成磁性微球偶聯SCC Ab1-SCC Ag-吖啶磺酰胺標記SCC Ab2的復合物，在施加磁場的作用下，通過洗滌將沒有結合的游離蛋白與免疫復合物分離，復合物在激發液的作用下發光，相對發光強度（RLU）與樣本中的SCC-Ag濃度呈正相關，從而研制出直接化學發光免疫分析法定量檢測鱗狀細胞癌抗原SCC-Ag的試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

SCC抗體配對，上海領潮生物科技有限公司；SCC校準品、糖類抗原CA125、CA153、CA199、CA724，血細胞角蛋白19片段Cy21-1標準品，上海領潮生物科技有限公司；人血清白蛋白、膽紅素、血紅素、甘油三酯、二甲基亞砜（DMSO）、賴氨酸，Sigma-Aldrich公司；甲胎蛋白AFP，雙流正龍生化制品研究室；癌胚抗原CEA，廈門光免生物技術有限公司；磁性微球（羧基，2.9 μm），日本JSR株式會社；吖啶磺酰胺（NSP-SA-NHS），深圳市美凱特科技有限公司；脫鹽柱，Thermo fisher公司；牛血清白蛋白BSA，德國Merck公司；碳化二亞胺（EDC）、嗎啉乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），Sigma-Aldrich公司；TBST緩沖液、PBST緩沖液、CB緩沖液，北京譜析科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器

SMART 6500全自動化學發光測定儀，科斯邁生物科技有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜，Agilent Technologies。

1.1.3 臨床樣本

定值人血清100例，福建醫科大學附屬協和醫院提供，定值結果由羅氏電化學發光檢測。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制方法

（1）磁珠儲存液配制。用pH 7.4、濃度為0.025 mol/L的TBST緩沖溶液溶解BSA至0.1%的濃度。（2）吖啶標記抗體保存液配制。pH 6.5、濃度為0.01 mol/L PBST溶液，加入1% BSA、5%蔗糖、0.01% NaN3。（3）激發液配制。激發液A：0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3；激發液B：0.2 mol/L NaOH+1% TritonX-100。

1.2.2 磁性微球偶聯SCC-Ab1制備

取10 mg羧基修飾的磁性微球混懸液于樣品管中，加pH 5.0、濃度0.1 mol/mL MES溶液900 μL混勻，然后分別加100μL 10 mg/mL EDC溶液和200 μL 10 mg/mL NHS溶液，室溫反應30 min，活化磁性微球；去上清，磁珠重新混懸液于1 mL MES溶液（pH 5.0、濃度0.1 mol/mL）；隨后直接加入SCC-Ab1 100 μg，37 ℃孵育3 h；去上清，加入磁珠儲存液1 000 μL，室溫封閉1 h后，用0.025 mol/mL TBST緩沖液洗滌4次，除去游離抗體，加入磁珠儲存液1 000 μL存放于2～8 ℃冰箱中備用，使用時用磁珠儲存液稀釋。

1.2.3 吖啶磺酰胺標記SCC Ab2制備

取適量抗體，用50 mmol/L pH 9.2的CB稀釋至1 mg/mL，脫鹽柱純化；計算抗體的摩爾數，在純化后的抗體中加入15倍摩爾數的NSP-SA-NHS（DMSO稀釋），4 ℃避光反應1 h；加入20倍抗體摩爾數的賴氨酸避光反應30 min，用高效液相色譜（流動相：pH 6.5、濃度0.1 mol/L的PBS緩沖液；色譜柱：分子篩色譜柱，紫外檢測器：波長280 nm）純化標記后的復合物，加入等體積甘油于-20 ℃下凍存，使用時用吖啶標記抗體保存液稀釋。

1.2.4 實驗方法

20 μL待測樣本，100 μL吖啶磺酰胺標記SCC Ab2結合物和20 μL磁性微球偶聯SCC-Ab1結合物加入樣品杯中；37 ℃條件下溫育20 min后，洗滌液清洗3次；加入激發液A 100 μL，激發液B 100 μL，檢測相對發光強度。全自動化學發光儀器參數按上面的步驟設置。

1.2.5 數據分析

在免疫反應中，對校準品或樣品采用兩個平行孔測定，取其平均值，相對發光強度值（RLU）和校準品（或樣品）濃度進行對數線性回歸，其回歸方程為：lg(Y)=A+Blg(X)。

2 結果與分析

2.1 試劑配對工作抗體濃度的選擇

磁性微球-SCCAb1結合物與吖啶磺酰胺-SCC Ab2結合物的用量和搭配對實驗結果有較大影響。對兩個抗體結合物的濃度進行優化，檢測樣本為30 ng/mL的SCC校準品；按實驗方法操作，結果顯示，對磁性微球-SCCAb1結合物分析磁珠濃度0.1～1.0 mg/mL范圍內變化；隨著磁珠濃度的升高，發光信號也隨之升高，直到磁珠濃度為0.5 mg/mL時，發光信號達到穩定狀態，因此選擇磁性微球-SCCAb1結合物磁珠濃度為0.5 mg/mL；保持結合物中磁珠濃度為0.5 mg/mL不變，隨著吖啶磺酰胺-SCC Ab2結合物的抗體濃度從0.8 μg/mL減小到0.1 μg/mL，化學發光信號都一直在降低，考慮到反應靈敏度和試劑成本，選擇吖啶磺酰胺-SCC Ab2結合物抗體濃度為0.4 μg/mL。

2.1 線性范圍

將接近線性范圍上限標準品（200 ng/mL）的樣本用正常人血清稀釋6個濃度，其中稀釋的最小濃度1.2 ng/mL接近線性范圍下限。對每一個樣本均檢測3次，計算平均值，相對發光強度值作對數線性擬合曲線。如圖1所示，線性范圍（1.2～200 ng/mL）內，線性相關系數R≥0.999，顯示了良好的相關性。

圖1 直接化學發光法測定SCC-Ag的標準曲線

2.2 最低檢出限

用零濃度校準品作為樣本進行檢測，重復測度20次，得出20次檢測結果的RLU值，計算其平均值（）和標準差（SD），根據零濃度校準品和1.2 ng/mL校準品之間的濃度-化學發光（RLU）值結果，進行兩點回歸擬合得出一次方程，將+2SD所對應的RLU值帶入方程式中，求出對應的濃度值，為0.1 ng/mL，即為最低檢出限。

2.3 精密性

批內精密性，用10 ng/mL、100 ng/mL 2個濃度SCC-校準品，每個濃度平行檢測10次，分別求其x—和SD，根據公式（1）求得批內變異系數（CV）≤5%。批間精密性，制備3批試劑，同時測定濃度10 ng/mL、100 ng/mL 2個濃度SCC校準品，每個批次檢測10次，計算30次結果的x—和SD，根據公式（1）求得批間變異系數（CV）≤10%。

2.4 回收率

將濃度為30 ng/mL、100 ng/mL的SCC校準品中加入3份正常人血清樣品（內源性檢測濃度均低于1.0 ng/mL）中，所加入SCC校準品與血清之間體積比為1∶9，測定的回收率在90.1%～106.7%范圍內，平均回收率98.7%。

2.5 穩定性

將全套試劑37 ℃放置6 d，檢測標準品，相對發光強度與放置前對比，確定熱穩定性的變化幅度≤10%；全套試劑按試劑儲存條件（2～8 ℃）下放置1年，檢測標準品，相對發光強度與放置前對比，確定長期穩定性的變化幅度≤15%。

2.6 比對試驗

檢測福建醫科大學附屬協和醫院提供的合理分布在線性區間內不同濃度100例臨床標本，并與羅氏電化學發光SCC-Ag測定結果對比。如圖2所示，回歸方程為y=1.035x-0.199，相關系數R2=0.989 4，表明兩者測試血清中SCC-Ag的含量具有良好的相關性。

圖2 本研究試劑盒檢測結果與羅氏電化學試劑測定結果比對

2.7 特異性

如表1所示，通過與常見的干擾因素人血清白蛋白、甘油三酯、血紅素、膽紅素，常見腫瘤標志物 AFP、CEA、CA125、CA153、CA199、CA724、Cy21-1進行交叉反應，得到測定值均小于0.1 ng/mL，表明該方法具有良好的特異性。

表1 試劑特異性分析

SCC-Ag是腫瘤相關抗原TA-4的亞型，Kato和Torigoe于1977年首次描述了該抗原[3]。早期研究發現，宮頸鱗狀細胞癌患者血清TA-4水平高于正常對照組水平[4]；SCC-Ag由鱗狀上皮細胞產生，是檢測鱗癌較好的標志物，該物質最早發現于宮頸鱗癌中，后來逐漸在食管、咽和肺癌中發現。血清SCC-Ag水平不僅可以反映鱗狀上皮細胞癌患者的病變程度，還有助于判斷患者的預后、監測疾病復發及療效。隨著化學發光法的日益推廣，SCC-Ag的臨床應用日漸受到重視。

化學發光免疫分析（Chemiluminescence Immuno-Assay，CLIA）是在世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析技術，可以根據化學反應產生的發光強度來確定物質的含量，該方法在生物醫學研究和臨床檢測中已經得到了廣泛的應用[5]。本文研究采用的發光劑是吖啶磺酰胺，它不需要催化劑、只需改變溶液的pH等條件就能直接發光，反應迅速、背景低、信比高；磁性微球具有良好的生物相容性，在免疫分析中經常被作為固相載體負載抗體抗原。在磁場的作用下，磁性分離簡化了測定過程中所需要的洗滌、分離操作，使檢測更簡便、快速，可以實現微量樣品的有效分離。

3 結論

本研究成功研制出定量測定人血清中SCC-Ag的直接化學發光分析試劑，具有靈敏度高、特異性好、穩定好、線性范圍廣等特點，并且將該試劑應用于臨床人血清中SCC-Ag的測定，與臨床分析界公認的羅氏全自動電化學發光儀的測定值進行了對比，顯示相關性很好。因此，本試劑具備良好的臨床應用前景。