徐斯盛，郭抗蕭，臧婧蕾，周羽

（長沙衛(wèi)生職業(yè)學院，湖南長沙 410001）

有關(guān)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)常喝茶可以有效預(yù)防VEGF導(dǎo)致的角膜血管的產(chǎn)生[1]，茶葉中的綠茶多酚進入體內(nèi)有效阻止了皮細胞的進一步增生，致使小血管的數(shù)目與長度顯著降低。但綠茶多酚在設(shè)計相應(yīng)的抑制藥物等領(lǐng)域仍沒有邁出具有突破性的一步。所以，把綠茶多酚運用于抑制性新藥物的設(shè)計中實際意義重大。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶多酚中兒茶素類化合物的主要成分，本研究利用其抑制特性以及潛在的抗癌性對綠茶多酚作進一步研究，以期找到有效抑制癌細胞增殖的化合藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

肝癌細胞株HepG2，湖南豐暉生物科技有限公司產(chǎn)品。HepG2細胞株適應(yīng)于青霉素與鏈霉素皆為100 U/mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為：溫度37 ℃、濕度充足、CO2含量5%。茶鮮葉，長沙普韻茶葉有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS），長沙中天生物技術(shù)開發(fā)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基，杭州吉諾公司；胰酶、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶、硫酸基轉(zhuǎn)移酶（SULT）、PAPS硫酸基供體、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，湖南天合生物公司產(chǎn)品；噻唑藍（MTT），Sigma；DAPI試劑，長沙維世爾公司；AnnexinV—F1TC試劑盒，上海市臥宏公司；二甲基亞砜（DMSO），上海艾銳化工有限公司。

3H24RI臺式智能高速離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；DM6 B熒光顯微鏡，德國徠卡；LSRII流式細胞檢測儀，長沙科文生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預(yù)處理

茶鮮葉充分曬干，抑制多酚氧化酶活性，保留30%的綠茶多酚，在20 ℃環(huán)境下稱取磨碎茶樣2 g，用300 mL超純水煮沸，50 min后靜置冷卻再過濾，濾液用PBS制備成10 g/L濃度的溶液，再次過濾殺菌后避光低溫貯存，用前稀釋至指定濃度。用PBS配制濃度為5 g/L的MTT溶液，過濾殺菌后低溫貯存待用。

1.3.2 肝癌HepG2細胞培養(yǎng)

在15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)，并以濃度為0.15%的胰酶消化。用臺盼藍染色法統(tǒng)計細胞數(shù)量，2.0×104個/cm2接種傳代，直至細胞濃度為80%時即可用于試驗，試驗前用胰酶消化。

1.3.3 EGCG的甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化

兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶可實現(xiàn)兒茶素進一步甲基化，SULT將PAPS硫酸基供體轉(zhuǎn)至醇、胺類的受體分子中，實現(xiàn)EGCG的硫酸化；葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶將綠茶多酚轉(zhuǎn)化為Ⅱ相代謝化合物質(zhì)，完成EGCG的葡萄糖醛酸化[2]。因此，綠茶多酚中的EGCG經(jīng)由甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化后得到的代謝化合物質(zhì)，能有效抗衰老和抑制癌細胞的活性與增殖，其過程如圖1所示。EGCG甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化后，對細胞具備一定的抑制作用，為癌癥的防治帶來了不錯的效果，但綠茶多酚的代謝及化合反應(yīng)也產(chǎn)生了代謝不穩(wěn)定、藥效時間短和藥物成分利用率不高的問題。這就需要借助基于藥理學機制的藥物制備策略來彌補這些缺陷[3]。

1.4 MTT實驗分析EGCG合成藥物的抑制作用

借助胰酶消化肝癌HepG2細胞，制成濃度為50個/mL的單細胞懸液，放進圓底96孔的細胞培養(yǎng)模板中，每孔0.2 mL。（1）不同劑量的EGCG合成藥物對肝癌HepG2細胞的抑制作用：肝癌HepG2細胞暴露培養(yǎng)的時間為48 h，RPMI1640培養(yǎng)基中EGCG合成藥物劑量為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L；（2）EGCG合成藥物暴露時間對肝癌HepG2細胞的抑制作用：使用EGCG合成藥物劑量為100 mg/L的RPMI1640培養(yǎng)基，暴露培養(yǎng)肝癌HepG2細胞12 h、24 h、48 h及72 h。在實驗結(jié)束前4 h，每個孔分別加入MTT液10 mL，再培養(yǎng)4 h，去掉上清液，每孔放入DMSO 150 μL，避光振蕩5 min，計算各組的肝癌HepG2細胞存活率。

1.5 驗證方法

1.5.1 DAPI染色法

圖1 EGCG的甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化過程

把培養(yǎng)好的HepG2細胞用PBS清洗幾次，加入250 mL基于PBS制備的3 mg/L的DAPI，室溫中培養(yǎng)0.5 h后，在熒光顯微鏡下觀察EGCG合成藥物誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡時細胞核的形態(tài)變化。

1.5.2 AnnexinV-FITC檢測法

把收集的HepG2細胞再培養(yǎng)48 h，做離心處理后用PBS清洗幾次，加入1O mL AnnexinV—FITC試劑，搖勻避光室溫靜置0.5 h，再用流式細胞儀分析檢測肝癌HepG2細胞的凋亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DAPI染色法的觀察結(jié)果與分析

用EGCG合成藥物（100 mg/L）處理的HepG2細胞進行DAPI染色后，通過熒光顯微鏡觀察到正常細胞的細胞核形態(tài)為染色質(zhì)均勻分布、核膜等結(jié)構(gòu)完整、細胞核整體呈藍色；而凋亡細胞的細胞核雖然也為藍色，但染色質(zhì)表現(xiàn)出極大程度的波折濃縮、凝聚邊緣化形態(tài)，出現(xiàn)了凋亡小體以及細胞核碎塊（如圖2所示），證明EGCG合成藥物可以誘發(fā)HepG2細胞的凋亡。

圖2 凋亡細胞的細胞核染色質(zhì)形態(tài)變化過程

2.2 基于AnnexinV—FITC檢測法的觀察結(jié)果與分析

如圖3所示，劑量不同的EGCG合成藥物作用于肝癌HepG2細胞48 h后，隨著EGCG合成藥物濃度的增大，細胞存活率逐漸下降，呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴關(guān)系。

如圖4所示，100 mg/L EGCG合成藥物分別作用于肝癌HepG2細胞12 h、24 h、48 h、72 h后，各處理組的細胞數(shù)目變化程度存在差異，反映出顯著的時間依賴關(guān)系，且暴露時間越長，細胞存活率越低。

圖3 不同劑量EGCG合成藥物對細胞的抑制

圖4 EGCG合成藥物不同暴露時間對細胞的抑制

3 結(jié)論

EGCG合成藥物對肝癌HepG2細胞活性及增殖具有顯著抑制作用，并受到藥物劑量與作用時間的影響。DAPI染色法與AnnexinV—FITC驗證表明，EGCG合成藥物可以誘發(fā)HepG2細胞的凋亡，且在一定限度內(nèi)細胞凋亡率與藥物劑量、作用時間存在正相關(guān)關(guān)系。綜上所述，綠茶多酚在臨床治療藥物運用過程中，對時間與劑量依賴程度較大，還有待進一步研究其用量以及藥物學原理。