HPLC法測定清咽丸中靛藍的含量

馮娟，郭均怡，覃亮*

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520；2.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

清咽丸主治功能為清熱利咽、生津止渴，常用于肺胃熱盛所致的咽喉腫痛、聲音沙啞、口舌干燥、咽下不利等癥狀，緩解咽部不適。青黛作為清咽丸的成分之一，其性咸、寒，無毒，入肝、肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血、解毒消斑、清肝去火、定驚等功效[1]。在醫(yī)學(xué)研究方面，研究發(fā)現(xiàn)青黛含有靛藍、靛玉紅、青黛酮、β-谷甾醇、色胺酮等有效成分[2-5]，其中靛藍是一種衍生自前體物吲哚的芳香族化合物，在天然植物中提取出來的植物靛藍具有清熱解毒、消斑、止血、抗炎、抗衰老、抗疲勞、抗癌、保肝等作用[6]。雖然青黛在清咽丸中起著清熱解毒、緩解肝火所致的咽喉腫痛的重要作用，但在藥典以及其他文獻均沒有關(guān)于青黛在清咽丸中的定量指標，本研究根據(jù)《中國藥典》2015版一部和對中成藥中靛藍進行含量測定的相關(guān)文獻[7]，對清咽丸中的靛藍進行含量測定方法探究和驗證，以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證發(fā)揮藥品主要功效。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

LC-20A高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；XS205DU電子天平（十萬分之一），METTLER TOLEDO公司；KO-500E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UPR-IV-20T優(yōu)普系列超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 試劑

清咽丸（大蜜丸）購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號17010634、17013112、16022745；靛藍對照品購于中國食品藥品檢定研究院；高效液相色譜儀所用乙腈為色譜純，廣州化學(xué)試劑廠；N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯、氯仿均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠，所用水為超純水。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液的制備

用電子天平精密稱取靛藍對照品2.51 mg置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量N,N-二甲基甲酰胺超聲使靛藍對照品完全溶解，待冷卻至室溫后加入N,N-二甲基甲酰胺稀釋定容至刻度線，搖勻即得濃度為50.2 μg/mL的靛藍對照品母液。從母液中精密吸取4 mL置于10 mL容量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺稀釋定容至刻度線，即得濃度為20.1 μg/mL的靛藍對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取清咽丸（批號17010634）足量，剪碎并混勻，精密稱取適量剪碎的藥品于銅盅，同時精密稱取相同質(zhì)量的硅藻土置于銅盅，研勻至細密均一、顏色一致、無大顆粒狀態(tài)，即為樣品。精密稱取3 g樣品于100 mL帶塞錐形瓶中，加入25 mL N,N-二甲基甲酰胺，精密稱定整體質(zhì)量，避光，超聲30 min，取出并冷卻至室溫后精密稱定質(zhì)量，加入N,N-二甲基甲酰胺補足失重，搖勻，取粗濾液適量，用0.45 μm濾頭濾過，取適量濾液作為供試品溶液。

1.3.3 陰性溶液的制備

按照清咽丸處方進行藥材配比，除青黛之外的其他八味藥材，粉碎成細粉，過5號網(wǎng)篩（80目）混勻備用。按照1.3.2項下的方法，制成缺少青黛的陰性樣品溶液，用0.45 μm濾頭濾過，取適量濾液作為供試品陰性溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μL），以十八硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為乙腈∶水=42∶58，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，泵壓≤25 MPa，定量方法為外標法，進樣量10 μL，檢測波長286 nm，理論塔板數(shù)按靛藍峰計算應(yīng)不低于3 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

吸取清咽丸供試品溶液、靛藍對照品溶液以及陰性樣品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，確定清咽丸除青黛這個藥材含有靛藍外無其他藥材成分干擾（圖1），故該法可以進行清咽丸中靛藍含量的測定。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

配制濃度為 12.6 μg/mL、15.1 μg/mL、20.1 μg/mL、25.1 μg/mL、30.1 μg/mL、50.2 μg/mL的靛藍對照品溶液，分別吸取10 μL溶液注入液相色譜儀，在“1.4”色譜條件下進行檢測，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制出靛藍對照品的標準曲線得到回歸方程Y=54 687X-41 567，R2=0.9998，圖2表明靛藍在12.6～50.2 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 不同濃度靛藍的出峰線性關(guān)系圖

2.3 精密度試驗

取濃度為20.1 μg/mL的靛藍對照品溶液在“1.4”色譜條件下連續(xù)進樣6次。2015版中國藥典規(guī)定，含量測定方法學(xué)驗證中，精密度試驗的相對標準偏差RSD需在3%范圍內(nèi)。本次實驗結(jié)果顯示，連續(xù)進樣6次的峰面積大小相近，峰面積分別為1 050 872、1 050 550、1 050 695、1 050 350、1 050 959、1 050 540，RSD=0.12%，說明方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密量取供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按照“1.4”色譜條件進行靛藍含量測定。結(jié)果顯示，不同時間段檢測靛藍的峰面積 為 1 108 006、1 106 491、1 105 664、1 104 983、1 104 532、1 103 074、1 098 996、1 098 600，平均值為1 103 791，RSD=0.31%（n=8），說明本品制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗

在“1.3.2”條件下制備6組重復(fù)性供試品溶液，按照“1.4”色譜條件進行靛藍含量測定。從實驗結(jié)果可知，清咽丸中靛藍的含量分別為2.019 1 mg/丸、2.000 7 mg/丸、2.005 7 mg/丸、2.010 2 mg/丸、2.018 4 mg/丸、2.002 9 mg/丸，平均值為2.009 5 mg/丸，RSD=0.78%，相對標準偏差較小，在藥典規(guī)定含量測定方法學(xué)驗證中關(guān)于重復(fù)性試驗相對標準偏差不大于3%的范圍內(nèi)，說明此方法重現(xiàn)性良好。

2.6 加樣回收試驗

取6份供試品進行加樣回收率試驗。對照品的加入量與樣品中靛藍含量之和在標準曲線的線性范圍內(nèi)，結(jié)果顯示同一批次的6份供試品溶液檢測得到的靛藍回收率分別為99.23%、98.89%、99.14%、99.49%、100.11%、100.13%，平均回收率為99.50%，RSD=0.52%，所測得的回收率結(jié)果均在藥典規(guī)定范圍內(nèi)，表明此含量測定方法可行。

2.7 供試品含量測定

取3個不同批次的供試品按照“1.3.2”制成供試品溶液，在“1.4”色譜條件下進行含量測定。如表1所示，3個不同批次的清咽丸中靛藍含量稍微不同，但其RSD均較小，說明此測定方法穩(wěn)定且可行性高。

表1 3組不同批號清咽丸中靛藍的含量

3 結(jié)論

通過實驗，確立了利用高效液相測定清咽丸中靛藍含量的方法，此方法高效便捷，可以快速有效地檢測出清咽丸中靛藍的含量，方法精密性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均良好，證明本實驗方法可有效地監(jiān)測清咽丸的質(zhì)量。