曹春哲

（復旦大學 生物工程系，上海 200438）

體外診斷試劑（In-Vitro Diagnostic，簡稱IVD）的生產中，溶液均質化是關鍵工藝步驟，決定試劑混合的均勻程度，并最終影響試劑的性能。

一般而言，混合時間定義為在混合容器中加入示蹤劑并達到一定均勻程度的時間[1]，工業通常使用95%均勻度記錄混合時間。Gabriel統計了近50年來的混合時間測定方法，大致上分為侵入式方法和非侵入式方法[2]，這兩類方法各自都有局限性，因此應當探索一種更為理想的混合時間測定方法，該方法應當既不影響流場狀態，又可用于非透明、體積較大的工業罐體，重復性好，測定終點易于判斷。

由于在IVD實際生產中主要使用水樣介質，因此應用水溶液檢查攪拌容器的混合性能。考慮在非侵入式方法中，尋找加強的顏色變化反應，使其可以應用到非透明的反應器中。比色法是確定混合時間的常用視覺方法，與使用傳感器進行局部測量相反，可以直觀顯示整個容器內容物的均質特性。本研究擬建立一種更適用于工業規模的混合時間測定方法，并利用該法探索對于混合時間有影響的因素，測試現有攪拌設備的性能并優化混合工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碘、碘化鉀、淀粉和五水合硫代硫酸鈉均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產；去離子水為羅氏診斷產品（蘇州）有限公司生產。

500 mL、1 000 mL量 筒，500 mL、1 000 mL、5 L燒杯，10 mL滴定管，VMR；5 L不銹鋼鍋、C21-WT2112T電磁爐，美的；RCT basic package 1電磁攪拌器，IKA；5 mL移液器，Eppendorf；2～8 ℃冰箱，MMM；Touchcontrol900 pH 計，Mettler Toledo；Touchcontrol900電導率儀，Mettler Toledo；Minebea Intec Maxxis 5電子天平，Sartorius。

1.2 溶液配制

1%淀粉溶液配制：10 g淀粉溶于200 mL去離子水中，攪拌均勻并倒入800 mL煮沸的去離子水中，煮沸后保持5 min并攪拌。淀粉溶液應當新鮮配制。

1 L I2-KI溶液配制：稱取250 g碘化鉀加入500 g去離子水配制碘化鉀溶液至完全溶解，再加入128 g碘單質混合至完全溶解，最后加入去離子水至1 L并混合5 min以上。

1 L硫代硫酸鈉溶液配制：將248 g五水合硫代硫酸鈉直接加入500 g去離子水中，加水至1 L混合至完全溶解。

I2-KI溶液和硫代硫酸鈉溶液應在2～8 ℃下避光保存。溶液配制無須精確使用容量瓶定容，且工業罐體測試所用溶液量較大，通常使用地磅或者天平稱重，關鍵參數為I2-KI溶液和硫代硫酸鈉溶液的滴定系數T，需要準確測定。

1.3 比色法測定混合時間

在攪拌設備中加入體積為V的去離子水和體積為0.005 0V的淀粉溶液（VS），100 r/min以上混合5 min；加入體積為 0.000 4V 的 I2-KI溶液（VI），100 r/min以上混合5 min；加入適量Na2S2O3溶液（VN），并在完全加入后記錄時間t0，一旦顏色在整個容器中消失，就停止測試并記錄時間t1，根據公式（1）計算混合時間（tm）。該過程中，VN根據公式（2）計算。如果重復測試，則加入少許I2-KI溶液至攪拌設備中，使其歸于中性點，終點顏色為微微亮藍色，下次測試從加入I2-KI溶液開始。

式（2）中，k是比例系數，取值范圍為0.9～1.2，其中0.9表明Na2S2O3體積為正常量的90%，1.2表明Na2S2O3過量20%；T為滴定系數，計算方法為：取10.0 mL I2-KI溶液，使用Na2S2O3滴定至褪色，消耗的Na2S2O3體積與I2-KI溶液體積（10.0 mL）的比值即為滴定系數。

1.3.1 比色法準確性和耐受性測試

準確性：對比I2-KI溶液體積，分別使用比例系數k為1.025、1.050、1.100和1.200對應體積的硫代硫酸鈉溶液進行測試，并在同條件下使用電導率測試混合時間，以電導率法測試結果為基準，查看比色法的準確性。

耐受性：對比硫代硫酸鈉體積添加量VN，分別使用比例系數k為0.900、0.950、1.000、1.025、1.050、1.100和1.200的硫代硫酸鈉溶液進行測試，查看比色法在加入不同的硫代硫酸鈉溶液體積的適用性。

1.3.2 比色法重復性和再現性測試

通過比色法測定各種混合容器的混合時間。

重復性：同一人員在同一設備，相同速度重復混合時間測試。

再現性：選取不同材質（不銹鋼SS，聚丙烯PP）混合設備，不同混合體積（35 L、100 L、350 L、3 000 L），不同混合速度（80～300 r/min），并由不同測試人員進行重復測試，確定混合時間，并計算變異系數來評價該方法的再現性。

1.3.3 混合設備性能確認測試

對可能影響混合設備性能的關鍵工藝參數進行了研究和評估。此處使用“最差條件法”進行混合設備性能確認，即在最大混合體積Vmax和最小混合速度nmin條件下，使用比色法進行35～3 000 L不銹鋼罐體和100～1 000 L聚丙烯罐體的混合時間測試。

在最大混合體積Vmax和最小混合速度nmin條件下，使用比色法進行35～3 000 L不銹鋼（SS）罐體和100～1 000 L聚丙烯（PP）罐體的混合時間測試，用以獲取混合設備性能并指導試劑生產的混合工藝。

1.3.4 IVD實際生產應用測試

根據文獻，密度差＜0.5 g/cm3時，預計不會影響混合時間[3]。血清和血漿的運動粘度在2 mPa·s的范圍內，因此與水的粘度1 mPa·s數量級相同。根據文獻對于粘度比水高兩個數量級以內的物質，如果在湍流狀態下進行混合，則混合時間幾乎不受粘度影響[4]。

以一種密度為1.010～1.037 g/cm3的IVD免疫產品為例，進行混合試驗。部分產品中應用到血清粘度為2 mPa·s，符合該測試方法的應用范圍。因此，在該產品的實際生產中，應用“1.3.3”比色法測得的混合時間作為生產工藝各個均質化步驟的混合時間進行生產，并在溶液的上中下3層各10個點均勻分布取樣測試電導率，評價試劑的混合均勻性。對比工藝設計中的15～30 min的混合時間，評價比色法測試混合時間的適用性，達到指導混合工藝優化的目的。

1.4 數據分析方法

采用Minitab 18.1統計學軟件處理數據，計量資料進行正態性檢驗，采用均數±標準差表示，進行正態性檢驗，P＞0.05符合正態分布；3組數據進行Bartlett等方差檢驗，P＞0.05方差齊性；3組數據進行方差分析的單因子方差分析，P＞0.05說明統計學上5 min、15 min、30 min混合質量無顯著差異。

2 結果與分析

2.1 比色法準確性和耐受性

如表1所示，相對I2-KI體積過量2.5%的硫代硫酸鈉是可行的，硫代硫酸鈉體積不足會導致溶液不褪色，體積過量會導致溶液褪色所得的混合時間與基準方法誤差增大。如硫代硫酸鈉體積過量較多，過高的濃度導致硫代硫酸鈉快速在溶液體系中消耗掉大部分碘單質導致褪色，而此時過量的硫代硫酸鈉尚未在攪拌作用下分散均勻，會導致測定的混合時間與基準方法誤差增大。根據測試結果，選取k=1.025作為硫代硫酸鈉溶液加入體積比例系數，即VN=1.025×T×VI。此條件下，測試方法的結果同電導率法測試結果對比，誤差較小，為3.4%。

2.2 比色法重復性和再現性

混合時間的變化是由于溶液體積測量的不準確、硫代硫酸鈉溶液的添加時間計時不準確、是否肉眼觀察判斷、是否可見顏色條紋不準確以及重復使用過程中中性點調節不準確和不同人員的測試習慣所致。如表2所示，4個重復測量的變異系數（CV）在2.7%～9.4%。將方法精度的上限設為10%，即如果測試混合時間為100 s，則認為110 s可以混合均勻，達到95%的混合質量。

表1 準確性和耐受性測試結果

表2 重復性和精密度測試結果

2.3 混合設備性能確認

如表3所示，在最大混合體積Vmax和最小混合速度nmin條件下，35～3 000 L不銹鋼（SS）罐體和100～1 000 L聚丙烯（PP）罐體最長的混合時間不超過4 min。

2.4 IVD實際生產應用

考慮到方法的準確性和商業風險，IVD實際生產中混合時間選取5 min。如表4所示，對5 min、15 min、30 min 3組數據進行正態性檢驗，P＞0.05，符合正態分布；3組數據進行Bartlett等方差檢驗，P＞0.05，方差齊性；3組數據進行方差分析的單因子方差分析，P＞0.05，說明統計學上3組混合質量無顯著差異。

表3 混合設備性能確認

表4 不同均質化混合時間電導率數據統計分析

對比原有參數，比色法獲取的混合時間從15～30 min縮短至5 min，混合質量無顯著差異。可以縮短生產混合時間，給予工業規模生產混合工藝的優化指導。典型的免疫產品約需要10步左右的均質化，包含加入鹽類、防腐劑、表面活性劑、抗原/抗體，pH調節以及子溶液混合等均質化步驟，如單個均質化步驟能從15 min縮短到5 min，單個溶液配制可以節約近2 h，原需要超過1個工作日完成的溶液配制工作有望在1個工作日內完成。相應的溶液配制人員和設備都可以解放出來進行下一批次的生產，提高生產效率，增加產能。

3 結論

該比色法以經典顏色變化反應（碘量）作為基礎，對不同規模的混合設備的混合時間進行了試驗測試，建立了最大到3 000 L的工業規模混合設備的混合時間測定方法。該法適用于一定密度和粘度范圍內的液體混合時間測定，測量結果相對準確。該法可以對現有的混合容器進行性能測試，用測得的混合時間指導和改進混合工藝，縮短混合時間，達到提高生產效率的目的。