不同提取方法對枸杞多糖提取率及糖含量的影響

李玲梅，張娟娟

（洛陽師范學院 食品與藥品學院，河南洛陽 471934）

目前,評價枸杞質量的指標通常是枸杞多糖（Lycium Barbarium Polysaccharides，LBP）、甜菜堿、總糖的含量，尤其以枸杞多糖為主[1]。研究證實，枸杞多糖在抗氧化、抗衰老、免疫調節等方面具有重要作用[2]。所以對其提取分離及其相關研究成為很多科研工作者的研究方向，也是對枸杞進行深加工和分子水平研究的基礎與前提。

常用的提取方法有水提醇沉法、酶提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[3]。陳靖等[4]采用冷浸法提取，通過正交實驗得出最佳提取工藝為料液比1∶6（g∶mL），冷浸3次，每次8 h。韓秋菊等[5]采用熱水浸提法提取枸杞多糖，通過正交實驗得出最佳工藝為料液比1∶20（g∶mL），溫度70 ℃，提取時間4 h，提取次數3次，提取率4.51%。熱水浸提法優點是試劑易得、條件簡單，適合游離多糖的提?。坏枰啻翁崛。僮鲿r間較長。胡仲秋等[6]通過堿提取枸杞多糖的最佳工藝為料液比1∶70（g∶mL），pH為10，溫度為65 ℃，浸提時間3.5 h，該條件下枸杞多糖的收率最高，并顯著優于傳統的熱水浸提法。堿提取法的原理是堿性條件下破壞細胞壁，有利于酸性多糖的提取，優點是能增加多糖含量，但提取成分復雜，還容易水解部分多糖，破壞多糖結構，導致提取率降低。李陽等[7]采用酶法提取枸杞多糖的最佳工藝為料液比1∶45（g∶mL），pH為3.5，溫度為55 ℃，提取時間2 h，提取率高達7.40%。酶法提取植物多糖是利用酶和熱水浸提相結合的方法，具有反應條件溫和、效率高、雜質易除、工藝簡便等優點，但是酶的價格較高，使用條件苛刻。史高峰等[8]采用微波輔助提取法研究枸杞多糖，通過正交實驗得出當以水為萃取溶劑，料液比1∶12（g∶mL），微波功率500 W，回流時間40 min時，枸杞多糖提取率高達13.56%。微波提取法能縮短提取時間、提高提取率、降低成本等，但由于能量巨大，會破壞有效成分。孟良玉等[9]采用超聲輔助提取技術，通過正交實驗得出當提取溫度60 ℃、溶劑比1∶50（g∶mL）、超聲提取40 min、提取2次時，提取率最高可達14.48%。超聲提取法的優點是可以大幅度提高有效成分的提取率，縮短提取時間，節省溶劑，污染小且有利于提取熱不穩定物質，能避免長時間高溫對有效成分的破壞。

枸杞作為我國傳統的藥食同源資源之一，雖然歷史悠久，但是以枸杞為原料的高附加值產品較少，目前開發利用多集中在粗放型加工的產品[10]。要對枸杞進行深加工，需要研究其主要的生物活性物質——枸杞多糖。通過比較不同提取方法的優缺點，探討在同溫同料液比條件下不同提取方法對枸杞多糖提取率及多糖含量的影響，為枸杞的深度開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞，產自中衛市中寧縣舟塔鄉潘營村。取枸杞原料于60 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過60目篩，備用。

苯酚，分析純，北京鼎國生物技術有限公司；葡萄糖對照品，分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；乙醇、丙酮、石油醚、濃硫酸，分析純，天津化學試劑廠。

1.2 儀器

FA2004電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；UV-2600紫外分光光度儀，日本島津公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技儀器有限公司；TD5Z離心機，華瑞科器有限公司；D2F-6020A真空干燥箱，恒諾利興有限公司；LC-N-1100D旋轉蒸發儀，力辰科技有限公司；FD-1B冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；KH-100E超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；WF-400微波快速反應系統，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 枸杞多糖的提取

1.3.1 熱水浸提法

準確稱取粉碎過的枸杞原料10.0 g于燒杯中，第1次按料液比1∶20（g∶mL）加入蒸餾水200 mL于90 ℃水浴中提取2 h，4 000 r/min離心10 min得到殘渣和提取液；第2次按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水100 mL于90 ℃水浴中提取1 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液，兩次提取液合并，60 ℃減壓濃縮至總體積的1/4；加入4倍量的95%乙醇，在4 ℃下沉淀12 h，抽濾，依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌沉淀，冷凍干燥后得到粗枸杞多糖，稱重。重復操作3次。

1.3.2 堿提取法

提取方法同“1.3.1”，在每次水浴前添加“用氨水調節溶液pH為10”步驟。

1.3.3 超聲提取法

提取方法同“1.3.1”，僅將“90 ℃水浴中提取2 h”改為“在超聲頻率為45 kHz、90 ℃下提取40 min”。

1.3.4 微波提取法

提取方法同“1.3.1”，僅將“90 ℃水浴中提取2 h”改為“在微波功率為300 W、90 ℃下提取20 min”。

1.4 枸杞多糖的純化

Saveg法除蛋白[11]：取枸杞多糖粗品加適量蒸餾水溶解，3 000 r/min離心10 min后取上清液，加30%雙氧水適量，40 ℃保溫4 h后，加三氯甲烷-正丁醇（4∶1）溶液沉淀蛋白，劇烈振搖后，棄去中層變性蛋白和下層氯仿層，取上清液；此步驟重復多次，直至無白色絮狀沉淀為止。然后濃縮提取液，水浴揮干溶劑，得到較純的枸杞多糖，冷凍干燥，備用。

1.5 枸杞多糖提取率的測定

根據公式（1）計算枸杞多糖提取率。

1.6 枸杞多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定枸杞多糖含量[12]。

1.6.1 制備標準溶液

將葡萄糖標準品在105 ℃干燥至恒重，準確稱取葡萄糖標準品100 mg于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容；準確量取10 mL于另一100 mL容量瓶中，定容，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.6.2 配制5%苯酚溶液

苯酚于60 ℃水浴加熱溶解后稱取150 g，加入0.1 g鋁片和0.05 g NaHCO3，進行常壓蒸餾，收集182 ℃的餾分，取餾分40 g加入10 mL蒸餾水置于50 mL棕色瓶內，于4 ℃冰箱保存備用。

1.6.3 繪制標準曲線

分別精密量取葡萄糖標準溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于試管中，加蒸餾水補足至2 mL；各試管加入1 mL 5%苯酚溶液搖勻，緩慢加入5 mL濃硫酸搖勻后于60 ℃恒溫水浴30 min，取出迅速冷卻至室溫；以蒸餾水為空白，在485 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[13]。

1.6.4 樣品含量的測定

準確稱取枸杞多糖樣品100 mg于100 mL容量瓶內，定容，精密量取10 mL于另一100 mL容量瓶，定容，搖勻，備用。

分別精密量取各枸杞多糖1.0 mL于具塞試管中，加入1 mL 5%的苯酚溶液搖勻，緩慢加入5 mL濃硫酸搖勻后于60 ℃恒溫水浴30 min，取出迅速冷卻至室溫，在485 nm波長處測定吸光度，平行測定3次。根據公式（2）計算枸杞多糖含量。

式（2）中，c為標準曲線上查得的濃度；D為樣品稀釋倍數；f=3.19為換算因子；m為樣品質量；v為量取的體積1 mL。

1.7 數據分析

采用Excel軟件對數據進行統計與分析，計算出平均值與標準差，采用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以葡萄糖標準溶液濃度x為橫坐標，吸光度值y為縱坐標進行線性回歸，得到線性方程y=8.508 9x+0.020 7，R2=0.997 9。葡萄糖標準溶液濃度在0.02～0.12 mg/mL與吸光度值之間線性關系良好。

圖1 標準曲線

2.2 枸杞多糖含量測定

枸杞多糖提取率和多糖含量如表2所示。不同方法的枸杞多糖提取率差異明顯，微波提取法＞超聲提取法＞堿提取法＞熱水浸提法；將其他3種方法與熱水浸提法進行比較，差異性明顯，其中微波提取法枸杞多糖提取率比熱水浸提法枸杞多糖提取率高6.05%；超聲提取法與微波提取法的多糖含量基本相同，超聲提取法最高，原因可能為枸杞粗多糖中含有水溶性色素或其他雜質成分影響含量測定結果。

表2 不同提取方法結果比較

3 結論

在浸提次數、料液比和提取溫度相同條件下，對比不同提取方法對枸杞多糖提取率及多糖含量的影響，得出微波提取法和超聲提取法在枸杞多糖提取率和多糖含量上均高于熱水浸提法，其中微波提取法的枸杞多糖提取率高達11.40%，多糖含量達86.13%，這為枸杞的深加工和枸杞多糖的進一步分離純化等研究奠定了基礎。