流感病毒裂解疫苗中游離甲醛殘留量的不確定度評(píng)定

馮雪，徐志強(qiáng)，張雪楠，趙琳，裴友財(cái)，楊紅育

（長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春 130012）

流感病毒裂解疫苗主要用于預(yù)防由流感病毒引起的流行性感冒。在生產(chǎn)過程中，一般加入適宜濃度的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活。因此，游離甲醛是疫苗檢測的一個(gè)重要指標(biāo)。目前，測定游離甲醛的主要方法有電化學(xué)法、分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法等[1-7]。本文根據(jù)CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[8]和JJF1059.1-2012《測量不確定度評(píng)定與表示》[9]規(guī)定的方法，對頂空-氣相色譜法測定流感病毒裂解疫苗中游離甲醛殘留量不確定度進(jìn)行分析，為提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

流感病毒裂解疫苗，長春生物制品研究所有限責(zé)任公司；100 μg/mL水中甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器設(shè)備

7890A型氣相色譜儀，配FID檢測器，7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱DB-1301（30 m × 0.320 mm，0.25 μm），Agilent TechnoLogies公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 頂空條件

頂空平衡溫度100 ℃，平衡時(shí)間30 min；定量環(huán)溫度110 ℃，傳輸線溫度120 ℃。

1.3.2 色譜條件

進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度250 ℃，柱溫60 ℃；保持時(shí)間10 min，恒定流量1.0 mL/min，分流比為20∶1；空氣流量400 mL/min，氫氣流量35 mL/min，尾吹流量25 mL/min；載氣為高純氮?dú)猓兌炔恍∮?9.999%。

1.4 測定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及測定

量取100 μg/mL水中甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用超純水稀釋，配制成濃度為0.001 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.040 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1.0 mL分別置于頂空瓶中，頂空蓋密封。按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定。

1.4.2 樣品測定

量取樣品1.0 mL置于頂空瓶中，頂空蓋密封。按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)學(xué)模型

1.5.1 計(jì)算公式

樣品中游離甲醛殘留量的計(jì)算公式如式（1）所示：

式（1）中，C為待測樣品中游離甲醛的質(zhì)量濃度，μg/mL；Ci為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出的游離甲醛的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.5.2 不確定度來源分析

從測定過程分析，測量不確定度主要來自以下4個(gè)方面：（1）重復(fù)測量樣品引入的不確定度；（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度；（3）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的不確定度；（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。依據(jù)JJF1059.1-2012規(guī)范，分析不確定度性質(zhì)可知，重復(fù)性測量引入的不確定度采用A類不確定度評(píng)定，其余分量采用B類不確定度評(píng)定[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度評(píng)定urel(A)

2.1.1 A類不確定度評(píng)定

A類不確定度主要由樣品重復(fù)測定引入，為獲得樣品重復(fù)測定的不確定度分量，對兩批流感病毒裂解疫苗及不同濃度的樣品溶液分別進(jìn)行3次重復(fù)測量，根據(jù)公式（2）和（3）計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表1。

2.1.2 B類不確定度評(píng)定urel(B)

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，相對擴(kuò)展不確定度為5%，k=2，因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程使用了0.1 mL、0.5 mL、5.0 mL分度吸量管，100 mL容量瓶，1 mL單標(biāo)線吸量管。根據(jù)校準(zhǔn)證書，玻璃量具引入的不確定度見表2。

表1 樣品重復(fù)測定及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果

在標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程中，使用0.1 mL分度吸量管1次，0.5 mL分度吸量管1次，5 mL分度吸量管1次，1 mL單標(biāo)線吸量管2次，2 mL單標(biāo)線吸量管1次，100 mL容量瓶6次，由表2數(shù)據(jù)合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如公式（4）所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中玻璃器具引入的不確定度

2.1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)中對每一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測定3次，得到相應(yīng)的峰面積。用最小二乘法對濃度和峰面積進(jìn)行擬合，得到直線方程y=ax+b及其相關(guān)系數(shù)，結(jié)果詳見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度與對應(yīng)的峰面積

根據(jù)公式（5）～（7）計(jì)算出測定不同濃度樣品時(shí)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，計(jì)算結(jié)果見表4。

式（5）～（7）中，Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度測定所對應(yīng)的峰面積；Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg/mL；s為標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物質(zhì)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，s=0.128；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，a=561.893 46；p為同一樣品測定的次數(shù)；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的總次數(shù)，共測定了5種不同濃度的溶液，每種濃度測定3次，n=5×3=15；x—為測定樣品中游離甲醛的平均濃度，μg/mL；c—為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度，

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

2.1.3 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)

綜合上述各不確定度分量，根據(jù)公式（8）計(jì)算相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表5。

2.1.4 擴(kuò)展不確定度與結(jié)果表示

按照一般慣例，取包含因子k=2，則相對擴(kuò)展不確定度為Urel=urel（c）×2。流感病毒裂解疫苗（批號(hào)20180712）的測量結(jié)果為0.001 672 62 μg/mL，Urel=31.54%；流感病毒裂解疫苗（批號(hào)20180718）的測量結(jié)果為 0.003 479 49 μg/mL，Urel=18.44%；0.006 μg/mL的樣品溶液測量結(jié)果為0.006 318 27 μg/mL，Urel=11.00%；0.01 μg/mL的樣品溶液的測量結(jié)果為0.009 893 79 μg/mL，Urel=7.50%；0.02 μg/mL 的樣品溶液的測量結(jié)果為0.019 328 73 μg/mL，Urel=5.96%。

表5 樣品的不確定度分量

3 結(jié)論

本研究從測量過程著手，識(shí)別和量化了各個(gè)來源的不確定度，并討論了待測物濃度不同時(shí)，各分量對總不確定度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)待測濃度較低時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對測定結(jié)果影響最大，重復(fù)測量及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)影響次之；隨著待測物濃度的提高，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對測定結(jié)果的影響逐漸減小。因此，可以增加標(biāo)準(zhǔn)系列溶液試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)，選用不確定度較小的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行多次重復(fù)測量，從而降低測量不確定度，提高測量的精密度及準(zhǔn)確度。