四種植物提取液對(duì)小麥赤霉病菌的抑制

許艷，周婷，張碩，王芳，劉松青

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610000）

小麥赤霉病作為一種典型的小麥病害，每年都給世界范圍內(nèi)的小麥生產(chǎn)帶來較大的損失[1]，在流行時(shí)期，病穗率達(dá)50%～100%，減產(chǎn)達(dá)到10%～40%。目前，對(duì)小麥赤霉病的防治主要從抗病育種、藥劑防治、生物防治及其他防治措施等方面進(jìn)行。由于農(nóng)藥的不斷施用，病原菌的抗藥性逐漸增強(qiáng)，再加上過量農(nóng)藥殘留易引起環(huán)境污染，生物防治技術(shù)逐漸引起重視。植物內(nèi)生菌因其特殊的生境及其生物多樣性，已經(jīng)被眾多專家認(rèn)為是植物病害生物防治的天然資源菌[2-4]。

近年來，國內(nèi)在植物源殺菌劑方面已取得了許多成果。殷帥文等[5]的研究表明，黃花草木樨乙醇提取物對(duì)小麥紋枯病菌和番茄灰霉病菌兩種菌有抑菌效果。石明旺等[6]發(fā)現(xiàn)鳳尾蘭植物提取液對(duì)小麥紋枯病菌有很好的抑菌效果。吳恭謙等［7］的研究表明，白頭翁素對(duì)禾谷鐮刀菌抑制作用很強(qiáng)。郭松等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，香樟葉、黃楊和刺槐提取物對(duì)小麥白粉病病菌有良好的抑制活性。蘭金榮等[9]研究結(jié)果顯示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的黃瑞香乙醇提取物對(duì)赤霉病及根腐病病原真菌抑菌效果較好,其抑菌率均達(dá)到50%以上。

本實(shí)驗(yàn)研究菟絲子、洋蔥、銀杏、魚腥草4種植物的植物提取液對(duì)小麥赤霉病的抑制。銀杏葉提取物作為天然物質(zhì)，其廣譜、高效的抗菌活性可有效用于食品的天然防腐或作為新型無副作用的抗菌藥物等方面；洋蔥含有各種有效的抑菌成分[10-13]，其提取物可抑制葡萄球菌屬、鏈球菌屬、弧菌、芽孢桿菌等多種微生物的生長；菟絲子的化學(xué)成分主要包括香豆精、黃酮、甾醇類、多糖等[14]，其提取物均具有一定的體外抗氧化活性[15]；魚腥草具有抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫力等作用[16]，其提取液中抑菌物質(zhì)對(duì)卡他球菌、金黃色葡萄球菌、流感桿菌等有明顯的抑制作用[17-18]。這4種植物均已被驗(yàn)證為藥用植物，具有一定的抑菌作用。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的在于對(duì)這4種常見植物進(jìn)行研究，觀察其植物提取液是否對(duì)病原菌產(chǎn)生抑制作用，找到適合做制劑的材料和合適的料液比，為豐富植物源的生防制劑品種以及開發(fā)植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥和魚腥草購于四川省成都市溫江區(qū)游家渡農(nóng)貿(mào)市場，菟絲子和銀杏采于四川省成都市溫江區(qū)成都師范學(xué)院校內(nèi)，供試部位分別為洋蔥肉質(zhì)鱗莖、魚腥草根、菟絲子根尖、銀杏葉。用于活化菌種的培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）。小麥赤霉病菌，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2 不同提取液的制備方法

將實(shí)驗(yàn)材料置于烘干箱中60 ℃烘干，高速攪拌機(jī)26 000 r/min粉碎2 min，過60目篩備用；將粉末與去離子水（水提法）或乙醇（醇提法）裝于10 mL EP管中浸提，料液比為1∶10（g∶mL）；將EP管放置于搖床中，180 r/min浸提24 h。靜置后分別用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾，收集濾液。將提取液于6 000 r/min離心10 min，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，收集濃縮液至10 mL EP管，密封，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫吹盟嵋夯虼继嵋骸?/p>

1.3 紙片抑菌法

抑菌效果采用紙片抑菌法測定。具體方法為：（1）用打孔機(jī)將濾紙打成直徑為5 mm的小圓片，在高溫滅菌鍋中，121 ℃滅菌15 min。（2）在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的PDA培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15～20 mL。待冷卻凝固后，將待試菌懸液分別用無菌移液管在無菌操作下取100 μL于培養(yǎng)皿中，用涂布棒將菌液涂布均勻。（3）用無菌鑷子夾取浸透提取液的濾紙片（將濾紙片提前在提取液中浸泡15 min左右），在試管內(nèi)壁瀝去多余水分，使濾紙片所含提取液基本一致，然后將其貼在含菌平板上，每皿貼2片，每種提取液做3次重復(fù)，每種提取液根據(jù)濃度不同，再做不同的重復(fù)。（4）培養(yǎng)皿置26～32 ℃恒溫培養(yǎng) 24～48 h，觀察有無抑菌作用，并測量抑菌圈大小，比較抑菌效果，有抑菌圈出現(xiàn)記為有抑菌作用（+），無抑菌圈出現(xiàn)記為無抑菌作用（-）。抑菌直徑d在9～13 mm是一個(gè)+，13～18 mm是2個(gè)+，≥18 mm為3個(gè)+。

1.4 抑菌試驗(yàn)

1.4.1 提取方法試驗(yàn)

參照“1.2”的方法，采用水提法和醇提法制備植物材料提取液，按照“1.3”的方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，記錄抑菌效果。

1.4.2 料液比實(shí)驗(yàn)

選用抑菌效果好的提取方法，進(jìn)一步進(jìn)行料液比實(shí)驗(yàn)。將粉末和95%乙醇按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）的料液比，在無菌條件下加蓋浸提，浸提方法同“1.2”。將各料液比下的提取液按照“1.3”的方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，記錄抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)供試菌株的抑制作用

如表1所示，不同植物的醇提取液對(duì)供試菌株有不同程度的抑菌活性。其中，菟絲子醇提物和洋蔥醇提物對(duì)供試菌株的抑菌效果較好，平均抑菌圈直徑達(dá)（19.15±1.05）mm和（16.77±1.06）mm，銀杏的醇提取物抑菌效果次之，抑菌圈直徑為（11.55±0.68）mm，魚腥草的醇提取物對(duì)供試菌株的抑菌效果不明顯。4種植物醇提液的抑菌效果由大到小排序?yàn)椋狠私z子醇提液＞洋蔥醇提液＞銀杏醇提液＞魚腥草醇提液。菟絲子水提取物對(duì)供試菌株的抑菌效果較好，平均抑菌圈直徑達(dá)（15.33±0.55）mm，洋蔥水提取物和銀杏水提取物對(duì)供試菌株的抑菌效果次之，魚腥草的水提取物對(duì)供試菌株的抑菌效果不明顯。4種植物水提液的抑菌效果由大到小排序?yàn)椋狠私z子水提液＞洋蔥水提液＞銀杏水提液＞魚腥草水提液。

表1 供試4種植物的提取液對(duì)供試菌株的抑菌活性

由以上結(jié)果可知，菟絲子和洋蔥的水提物和醇提物對(duì)供試菌株有不同程度的抑菌活性，且菟絲子和洋蔥的植物醇提液抑菌性均優(yōu)于水提液，銀杏的水提液和醇提液抑菌效果趨同，魚腥草的水提液和醇提液均沒有體現(xiàn)抑菌性。

2.2 不同料液比的醇提取液對(duì)供試菌株的抑菌效果

如表2所示，4種植物的不同料液比醇提取液對(duì)供試菌株有不同的抑菌活性。其中，4種植物在料液比為1∶20時(shí)，抑菌效果都是最好的，1∶10料液比下抑菌效果次之，1∶30和1∶50料液比下抑菌效果不明顯。

在1∶20料液比下，菟絲子和洋蔥醇提取液對(duì)供試菌株的抑菌效果較好，平均抑菌圈直徑分別為（21.05±0.65）mm和（18.95±0.55）mm；銀杏醇提取液抑菌效果次之，平均抑菌圈直徑為（10.55±0.68）mm；魚腥草醇提液沒有明顯抑菌效果。4種植物1∶20料液比下醇提液的抑菌效果由大到小排序?yàn)椋狠私z子醇提液＞洋蔥醇提液＞銀杏醇提液＞魚腥草醇提液。

菟絲子、洋蔥、銀杏的植物提取液對(duì)小麥赤霉病菌具有一定的抑菌效果，而魚腥草沒有體現(xiàn)抑菌性。黃亮等[19]對(duì)魚腥草葉、莖、根提取液進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，魚腥草葉具有較強(qiáng)的抑菌活性，莖次之，而魚腥草根幾乎沒有抑菌活性。本實(shí)驗(yàn)魚腥草提取液沒有抑菌活性是由于選取的材料為魚腥草根，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象符合黃亮等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 4種植物的不同料液比醇提取液對(duì)供試菌株有不同的抑菌活性

菟絲子和洋蔥的醇提取液抑菌效果明顯優(yōu)于水提取液抑菌效果。熊素英[20]在石榴皮抑菌液的制備及抑菌特性研究中表明，乙醇提取液優(yōu)于水提取液且乙醇提取液對(duì)微生物有較好的抑制。蔣益虹[21]在荷葉抑菌活性成分的研究中采用不同極性溶劑分離得到的荷葉各提取物中，得出乙醇部位提取得率最高，抑菌活性最強(qiáng)，且乙醇提取液在低溫下可以快速濃縮。這與本實(shí)驗(yàn)醇提取液抑菌效果明顯優(yōu)于水提取液抑菌效果的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。可能原因是天然植物中含有的多種抑菌活性成分：如銀杏葉提取物中的黃酮苷、萜內(nèi)酯，魚腥草和菟絲子提取物中的黃酮類大多數(shù)為脂溶性成分，用水提法制備不能充分提取。供試菌株的抑菌效果并不是隨料液比越高越好，通過表2可以看出當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)抑菌效果最好，料液比為1∶10（g∶mL）時(shí)抑菌效果反而不明顯。

菟絲子是入侵生物，具有寄主范圍廣、危害嚴(yán)重、擴(kuò)散蔓延迅速、極難根除等特點(diǎn)，對(duì)于菟絲子的有效利用能變廢為寶。在1∶20（g∶mL）料液比條件下，洋蔥與菟絲子醇提液效果差別不大，考慮經(jīng)濟(jì)性，可選擇菟絲子1∶20（g∶mL）醇提液開發(fā)抑菌制劑。

3 結(jié)語

菟絲子、洋蔥、銀杏的植物提取液對(duì)小麥赤霉病菌具有一定的抑菌效果，魚腥草沒有體現(xiàn)抑菌性；選取植物醇提取液對(duì)于小麥赤霉病菌的抑菌效果比水提取液的抑菌效果更好；在1∶20（g∶mL）料液比條件下，洋蔥與菟絲子醇提液效果差別不大，優(yōu)先選擇菟絲子進(jìn)行小麥赤霉病的防治。