阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR區g.16767667位點G>A突變與其尾脂沉積能力關聯性分析

張 偉，王世銀，高 莉，徐夢思，王新華*，甘尚權(. 新疆農墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆 石河子 83000；. 新疆農業職業技術學院，新疆 昌吉 8300)

脂肪特異性27 kDa蛋白(Fat specific protein 27, Fsp27)最早在鼠脂肪細胞系TA1中篩選特殊基因表達時被發現[1]，在脂肪組織中高表達，在促進脂肪細胞中脂滴融合和抑制脂肪分解過程中發揮重要作用[2-4]。鼠敲除Fsp27基因后脂肪水解速率顯著升高，脂肪細胞中的大脂滴轉變成為很多分散均勻的小脂滴[5]。本課題組前期對不同尾脂沉積能力綿羊品種Fsp27基因序列突變情況進行了系統研究，在該基因5'UTR區、CDS區和3'UTR區發現了大量的SNP位點。初步分析結果表明，部分位點在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的分布具有明顯的差異性。前期研究結果表明，在上述SNP位點中5'UTR區g.16767667位點G>A突變在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的分布差異顯著，可能與綿羊的尾脂沉積能力具有相關性。本文將以尾脂沉積能力極強的阿勒泰羊為研究對象，對Fsp27基因5'UTR區g.16767667位點G>A突變與阿勒泰羊尾脂沉積能力關聯性進行深入分析，以期為進一步闡明Fsp27基因在阿勒泰羊優良尾脂性狀形成中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及脂尾體積測量

本試驗所用250份阿勒泰羊耳組織采自新疆阿勒泰地區富蘊縣阿勒泰羊種群核心群1.5～2歲個體，每份樣品進行編號，同時測量該樣品對應個體脂尾的長、寬和厚，并記錄該阿勒泰羊的性別，以備后期分析。采集的耳組織4 ℃暫時冷藏保存，并盡快運回實驗室置于-20 ℃冰箱中保存備用，用于提取阿勒泰羊基因組。

1.2 DNA提取

耳組織樣品基因組DNA采用動物組織基因組DNA提取試劑盒(索萊寶，中國)提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 引物設計

檢索Ensemble網站(http://asia.ensembl.org/index.html)，獲得綿羊Fsp27基因序列，然后與UCSC中(http://genome.ucsc.edu/)收錄的綿羊基因組序列(Oar_v4.0, Nov. 2015)比對，截取包含Fsp27基因5'UTR區的序列共計780 bp設計引物，上游引物序列：TGCCGACGTAAGATGGACTCTG，下游序列：TCTGCGATGGAGATTGGGGATC，Tm值58 ℃，擴增片段大小365 bp，g.16767667位點位于擴增片段靠近中部位置，以利于后續進行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)檢測。引物使用Oligo 6.0軟件設計，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 PCR擴增及SSCP檢測

以阿勒泰羊基因組為模板，采用上述引物擴增阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR區，反應采用20 μL體系 Premix Taq (TAKARA Taq Version 2.0 plus dye)10 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μM)，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后置于4 ℃冰箱保存備用。分別取2 μLPCR產物與8 μL變性上樣緩沖液混合，置于100 ℃金屬浴上變性10 min，迅速置于冰上降溫冷卻，然后全部上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，先300 V電壓下電泳5 min，然后在120 V下電泳12 h。電泳結束后將凝膠取下，進行銀染，然后置于凝膠成像儀(BIO-RAD)中拍照。

1.5 Fsp27基因突變情況檢測與其綿羊尾脂沉積能力關聯性

選擇SSCP帶型不同的PCR產物送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序，以確定不同基因型與SSCP帶型的對應關系，然后以此對250份阿勒泰羊基因組進行分型。將分型結果與前期測量的對應個體尾型數據進行對應分析，以找出不同基因型與阿勒泰羊脂尾體積數據的對應關系，進而對相應基因型阿勒泰羊的尾脂沉積能力做出評估。

1.6 數據分析

采用SPSS13.0軟件計算Fsp27基因g.16767667位點SNP的基因型頻率及等位基因頻率，并使用卡方檢驗的方法分析群體中基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡。阿勒泰羊尾形數據用平均數±標準差表示，并進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，多重比較采用最小顯著差數法(least significant difference, LSD)。

2 結果與分析

2.1 基因組提取及PCR擴增結果

采用瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組DNA和PCR產物進行檢測(圖1)，從電泳圖片可見提取的阿勒泰羊基因組DNA電泳條帶亮度較高，沒有明顯拖帶(圖1A)，說明提取的DNA濃度和質量均較高，可以滿足后期PCR擴增的要求。PCR擴增產物電泳結果條帶清晰明亮，沒有雜帶，條帶大小符合預期設計(圖1B)，說明引物的特異性和擴增效率均很高，為后期進行高質量SSCP檢測提供了保障。

圖1 阿勒泰羊部分基因組DNA(A)和Fsp27基因5'UTR 區PCR產物檢測(B)Fig.1 Detection of Altay sheep DNA (A) and PCR production of Fsp27 gene 5'UTR region (B)

2.2 SPSS分型及基因測序驗證

PCR產物經SSCP檢測可見三種不同的帶型(圖2A)，挑選不同帶型對應的PCR產物進行基因測序，可知三種帶型分別對應GG、AG和AA三種基因型(圖2B)。所以，Fsp27基因5'UTR區g.16767667位點G>A突變在阿勒泰羊群體中三種基因型均可以檢測到。

圖2 SSCP檢測結果(A)及相應PCR產物測序結果Fig.2 Result of SSCP detection (A) and sequencing data of corresponding PCR production (B)

2.3 不同基因型在阿勒泰羊群體中分布及與尾型數據的對應性分析

通過250份阿勒泰羊基因組DNA的檢測結果表明，Fsp27基因5'UTR區g.16767667位點G>A突變產生的三種基因型GG、AG和AA在阿勒泰羊群體中的分布存在明顯的差異。GG基因型個體占樣本總量的47.2%，AG基因型占38.4%，而AA基因型僅占14.4%，在檢測的阿勒泰羊群體中G等位基因頻率達66.4%，為優勢等位基因?？ǚ綑z驗結果表明，該位點在阿勒泰羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)，說明該位點在阿勒泰羊品種群體中處于遺傳平衡狀態，同時也可推測在阿勒泰羊的培育過程中該位點可能沒有受到選擇、遷移和遺傳漂變等的影響。

表1 g.16767667位點G>A突變基因頻率和基因型頻率在阿勒泰羊群體中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗Table 1 Genotypes and allele frequencies distributions of g. 16767667 locus G>A SNP in Altay sheep population and Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium

為了進一步分析g.16767667位點G>A突變不同基因型對阿勒泰羊尾脂沉積能力的影響，將不同基因型阿勒泰羊個體的尾形數據進行了對比分析(表2)。結果表明，不論是公羊還是母羊，GG和AG基因型個體脂尾(臀)的長、寬和厚3項數據均顯著高于AA基因型個體(P<0.05)，GG基因型個體亦略高于AG基因型個體，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 阿勒泰羊不同基因型個體尾形數據對比分析Table 2 Data comparison of fat tail size of Altay sheep with different genotype

3 討 論

有關綿羊SNP位點與脂肪沉積能力的關聯性已有相關文獻報道，本課題組前期在綿羊7號染色體和X染色體上發現了多個與綿羊尾脂沉積能力相關的SNP位點[6-9]，2012年伊朗學者Moradi等使用高密度SNP芯片對產于伊朗的脂尾和瘦尾綿羊品種進行全基因組精細掃描，亦檢測到大量與綿羊尾脂沉積能力相關的SNP位點[10]。本研究證實阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR區g.16767667位點G>A突變產生的三種基因型GG、AG和AA在阿勒泰羊群體中的分布存在明顯的差異，且與阿勒泰羊的尾形存在關聯性，GG和AG基因型的個體，脂尾(臀)的長、寬和厚三項數據均顯著高于AA基因型的個體(P<0.05)。這些SNP位點均與綿羊的尾脂沉積能力高度相關，所以可以作為很好的分子標記應用于低脂肪綿羊品種的選育。但是，這些SNP位點是否直接參與脂肪沉積，以及參與的途徑仍需后續開展深入的研究。

Fsp27基因在動物體脂肪代謝過程中所發揮的重要作用，已得到相關文獻的證實。Fsp27定位在脂肪細胞脂滴和的內質網表面[11-12]，通過促進小脂滴相互融合為大脂滴[3,13]，以及特異性抑制激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)在脂滴表面的定位，進而抑制其對脂肪的水解作用[4]，最終達到促進脂肪沉積，抑制脂肪分解的作用。Fsp27的半衰期很短，所以，機體通過調控Fsp27的表達水平可以快速響應體內脂肪酸的水平，進而保障了機體內脂肪的沉積和分解活動與機體的能量供應相適應[11]。本研究涉及的g.16767667位點G>A突變處于Fsp27基因5'UTR區，由于mRNA的5'UTR區與翻譯起始調控、穩定性、剪切加工及細胞內的運輸和定位等過程密切相關[21]，所以5'UTR區的基因突變很可能會影響上述生物學過程的正常進行，進而可能影響Fsp27基因mRNA的翻譯及其蛋白水平，并最終影響其生物學功能。本研究中GG和AG基因型個體尾形數據均顯著高于AA基因型的個體(P<0.05)，有可能與GG和AG基因型有利于Fsp27基因mRNA的翻譯，提高其蛋白水平，進而促進脂肪細胞中脂肪的沉積有關，但其具體作用機制尚有待進一步的研究。

阿勒泰羊的形成具有特定的人文和生態環境背景。阿勒泰羊主要生活在我國新疆北部的阿勒泰地區，當地生態環境的一個顯著特點是夏秋季節氣候涼爽、牧草豐茂，但是冬季枯草期漫長而寒冷。所以，生活在這里的野生草食動物或者純放牧狀態的草食家畜必須具備在短期內迅速在體內蓄積足夠脂肪的能力，否則無法順利越冬。另外，阿勒泰地區主要生活的是哈薩克族牧民，常年以放牧為生，在寒冷的冬季亦需要攝入大量的肉和脂肪來滿足機體的能量供應，抵御當地的寒冷天氣，所以歷代牧民加強了儲脂能力強的綿羊品種的選育。在這種自然和人為的雙重選育下才培育出了具有優良脂尾(臀)的阿勒泰羊。但是，近年來隨著人們生活水平的提高，人們對高脂肪肉食品攝入引起的心腦血管疾病發病率升高日益關注，市場對低脂肪羊肉的需求量日益增大[15]。另外，隨著草場保護政策的推進，以及舍飼養羊的逐漸普及和圈舍、飼草條件的改善，阿勒泰羊尾部脂肪的保命作用已沒有太多實際的價值。所以，該品種存在進一步選育提高，在保留其優良性狀的前提下逐步提高其胴體的瘦肉率的迫切需要。因而需要闡明其尾部脂肪沉積相關的分子調控機制，用于指導育種實踐，提高育種效率。就此而言，圍繞阿勒泰羊尾脂沉積開展相關功能基因研究又具有很大的現實意義。

4 結 論

本研究對Fsp27基因5'UTR區g.16767667位點G>A突變在阿勒泰羊群體中的分布以及與阿勒泰羊尾脂沉積能力進行了初步研究，發現GG和AG基因型在群體中的比重較大，且其尾形數據也顯著高于AA基因型個體，推測G等位基因有利于阿勒泰羊尾脂沉積。上述結果將為進一步闡明阿勒泰羊優良脂尾(臀)性狀的形成機制以及低脂肪綿羊品種的培育提供基礎數據。