甲狀腺乳頭狀癌自噬相關蛋白LC3與Beclin1及其調控基因的表達與分析*

陳興 鄭俊杰 張愛龍 游振輝

迄今為止，甲狀腺癌仍是目前臨床發病率最高的內分泌系統惡性腫瘤之一，約占總人口的1%[1]，且有逐年增長之趨勢[2]，其增速之快應得到臨床工作者的足夠重視。甲狀腺癌表現為幾種常見的亞型，包括甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡癌（follicular carcinoma，FC）、髓樣癌（medullary carcinoma，MC）、低分化癌（poorly differentiated carcinoma，PDC）和間變性癌（anaplastic carcinoma，AC），且臨床表現與預后各不相同，其中，PTC 亞型最為常見，占比可達85%～90%[3]。盡管PTC惡性度較低、發展緩慢、預后較好，但是仍有10%左右的患者在治療后期出現復發、侵襲的情況，且大概率發生淋巴結轉移，轉移率可達15%～50%；此外，淋巴結隱匿性轉移甚至高達70%～80%，極大程度影響了患者的無病生存期和死亡率[3-4]。因此，深入了解PTC 病因及發病機制顯得尤為重要。近年來，依托越來越完善的分子生物學技術，更多學者將組織病理結合分子生物學技術應用到PTC 研究領域。在腫瘤研究領域，自噬被認為是細胞溶酶體的降解，其在PTC 發生過程中的角色受到廣泛關注。目前認為自噬在腫瘤發生的起始階段，自噬可抑制腫瘤發生，但隨著體內腫瘤的發展，自噬在腫瘤發生、發展過程中可能扮演者雙重調節的作用[5]。

Beclin1 是調節細胞自噬現象的關鍵蛋白，同時也是細胞啟動自噬的標志[6]。人類微管相關蛋白輕鏈3（LC3）是編碼自噬相關蛋白的關鍵基因，參與了哺乳動物自噬形成中的泛素樣蛋白加工修飾過程，在細胞內以LC3-I 及LC3-Ⅱ兩種形式存在，并可通過檢測細胞內的LC3 及其向LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的轉化以判斷細胞自噬是被誘導還是被抑制[7-9]。現已知在人類LC3 蛋白有3 種亞型（LC3A、LC3B和LC3C），韓國學者Kim 等[1]研究表明，LC3 的兩個亞型LC3A 和LC3B 在不同病理類型的甲狀腺癌中的表達有所差異。鑒于此，為明確自噬相關蛋白LC3 與Beclin1 及其調控基因LC3A、LC3-B 和BECN1 在PTC 患者中發揮的作用及對患者預后的影響，本研究對20 例PTC 患者術后新鮮組織標本和20 例甲狀腺良性病變切除的正常甲狀腺新鮮組織標本進行了LC3 與Beclin1 及其調控基因表達情況的研究分析，探討細胞自噬在甲狀腺乳頭狀癌形成中的作用，旨在為PTC 患者的早期診斷提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析本院2018年12月-2019年12 月確診并行手術切除的PTC 患者20 例，同期因甲狀腺良性病變就診的患者20 例。納入標準：入組患者均為初診患者；患者臨床資料完整，術前未進行放療、化療、同位素治療及內分泌治療。排除標準：收住院期間詢問病史，術前合并其他腫瘤；二次或以上手術及復發；術后診斷為PTC 合并甲狀腺其他類亞型癌。入組患者（PTC 組和良性病變組）術中留取兩塊黃豆粒大小的新鮮組織，分別用于RT-PCR 檢測和Western Blot 檢測。所有用于科學研究的標本均置于-80 ℃冰箱中保存備用。本研究經過福建省立醫院倫理委員會審批，入組患者已被告知本研究內容并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 分別取前期保存的PTC 組織和良性病變甲狀腺組織各50 mg，加入1 mLTrizol 試劑冰上研磨，待測組織總RNA 的提取參照試劑盒說明書進行。抽提結束后，核酸濃度測定儀（260 nm）測定總RNA 濃度與純度，OD260/OD280=1.8～2.0，以確保RNA 達到可靠純度，同時電泳檢測RNA 的完整度。分別參考cDNA 第一鏈合成試劑盒（逆轉錄試劑盒）說明書及KAPA?SYBR?rapid quantitative PCR Kit 試劑盒操作步驟開展檢測。擴增體系：包括2 μL cDNA，0.5 U/mL TaqDNA 聚合酶，0.2 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×PCR Buffer（含0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L Tris-HCl pH 值8.3），1.5 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 目的基因引物，最后加ddH2O 至25.0 μL。反應體系：94 ℃ 5 min-94 ℃ 30 s-55 ℃ 30 s-72 ℃60 s，35 個循環后，72 ℃延伸10 min。目的基因及內參基因正、反向引物序列見表1，采用BIO-RAD Connect 熒光定量PCR 儀器進行數據分析。

表1 目的基因及內參基因正、反向引物序列

1.2.2 Western Blot 檢測 分別取前期保存的PTC組織和良性病變甲狀腺組織各約100 mg，用配制好的RIPA 裂解緩沖液制備蛋白裂解物，加入5 倍體積的裂解液于冰上充分研磨4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液重復上述步驟，再次離心取上清液，上清液經蛋白定量后，取60 μg 蛋白經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉2 h，一抗1∶1 000 孵育4 ℃過夜，用TTBS 充分洗膜后，加入二抗1∶4 000 室溫孵育1 h，TTBS 清洗顯色液顯色后，用掃描儀進行灰度掃描，照相經自動圖像分析系統進行分析。

1.3 統計學處理 使用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用獨立樣本t 檢驗，計數資料采用率（%）表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 PTC 組中男6 例，女14 例，平均年齡（42.3±5.2）歲；良性病變組中男5 例，女15 例，平均年齡（41.3±5.3）歲。兩組年齡、性別比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 RT-PCR 結果 RNA 抽提結束后，核酸濃度測定儀（260 nm）測定總RNA 濃度與純度均符合實驗要求，同時凝膠電泳顯示較好的RNA 完整性，見圖1A。RT-PCR 結果顯示，與良性病變甲狀腺組相比，PTC 組LC3B 基因mRNA 的相對表達（9.44±1.75）較良性組（2.09±0.37）顯著上 升（P=0.026 8），LC3A 基 因mRNA 的相對表達量（1.39±0.24）較良性組（1.32±0.46）略上調（P=0.792），BECN1 基 因mRNA 的相對表達量（1.20±0.25）較良性組（1.29±0.52）稍有降低（P=0.750）。見圖1B。

圖1 RT-PCR結果

2.3 兩組Beclin1 蛋白表達情況比較 Western Blot檢測結果顯示，惡性組Beclin1 蛋白表達（2.27±0.35）與良性組（1.96±0.16）比較，差異無統計學意義（P=0.059 5）。見圖2。

2.4 兩組中LC3A 和LC3B 蛋白表達情況比較 Western Blot 檢測結果顯示，惡性組LC3A 蛋白表達情況（0.76±0.02）與良性組（0.74±0.02）比較，差異無統計學意義（P=0.0604），LC3B 蛋白表達顯著性增強（0.79±0.16） vs （0.25±0.01）（P=0.000），LC3B/LC3A 比值顯著升高（1.04±0.02）vs （0.33±0.01）（P=0.000）。見圖3。

圖2 Beclin1蛋白相對表達量

圖3 LC3A和LC3B蛋白相對表達量

3 討論

PTC 是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，可于任何年齡階段發病，甚至在某些地區已成為發病率最高的惡性腫瘤[10]，但其惡性程度低，加上全民健康意識的提升，PTC 患者的10 生存率能高達90%以上[11]。然而，PTC 較高的侵襲性卻也導致患者病死率逐年增加。因此，需要在PTC 發生初期進行特異性高的早期篩查和針對性治療，確保在PTC 發生后患者均能得到有效治療和預防復發舉措，而尋找到PTC 相關的特異性分子標記物可有效地解決這一問題，為PTC 的診斷和治療提供新的理論依據。

細胞自噬是一種高度保守的生物行為，它可以對體內的大分子物質及細胞產生的內源性物質通過溶酶體途徑進行降解，是維持細胞平衡、內環境穩定以及基因穩定性必不可少的代謝過程[12-14]。細胞自噬作為3 種細胞程序性死亡方式之一，在形態學表型上具有一定的特點：自噬發生過程中，胞質中出現大量的自噬泡，其內包裹著胞質成分和細胞器，并與溶酶體融合后再降解。有研究表明，在自噬相關基因LC3 和BECN1 的調控下，人體內環境可利用自噬強弱影響腫瘤的發生、發展及預后[15-18]。Beclin1 基因是酵母自噬基因Atg6 的同源類似物，是第一個被鑒定的自噬基因，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因，Beclin1 基因通過調節自噬強弱進而對腫瘤的發生、發展起重要作用。LC3-Ⅱ作為自噬活動的特異性標志物，參與自噬的延伸并促進自噬體的形成，其表達水平的高低反映了自噬水平的高低[19]。在乳腺癌、大腸癌、肺癌、卵巢腫瘤、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均存在自噬活性失常現象[20-25]。同時，自噬在惡性腫瘤的發生、發展中可能起雙重作用，在不同器官腫瘤或同一器官不同類別腫瘤，甚至同一腫瘤的不同發展階段中的表達情況可能都會呈現出一定的差異性。陳小林等[15]研究表明，Beclin1 和LC3 在甲狀腺癌組織中呈低表達，導致表達降低的組織細胞的自噬能力降低，細胞生長周期增加，從而間接造成了胞增值能力和轉移能力的增強，為腫瘤的形成提供有利條件。然而，孫芳紅等[12]研究顯示，在大多數癌旁的甲狀腺組織細胞中LC3 呈低水平表達，而在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈強陽性表達。而在本研究中，相比于良性病變甲狀腺組織，惡性PTC 組織中Beclin1 蛋白上調表達，提示PTC 組織中細胞自噬活性增強，但未達到顯著性差異（P＞0.05）。考慮到LC3 蛋白受LC3A和LC3B 兩個基因的雙重調節，目前研究顯示LC3B基因顯著上調表達（P＜0.05），LC3A 基因略微上調表達（P＞0.05），為此，本課題組分別研究LC3A 和LC3B 在PTC 和良性病變甲狀腺組織中的表達情況，結果顯示PTC 組和良性組LC3A 蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05），而LC3B 蛋白表達具有顯著性差異，LC3B/LC3A 比值亦顯著升高（P＜0.05），提示PTC組織中細胞自噬活性顯著增強。目前與PTC 相關的LC3A 和LC3B 的研究相對較少，在開展PTC發生、發展與自噬蛋白相關性研究時，應綜合考慮LC3 及其亞型蛋白LC3A 和LC3B 在腫瘤組織中表達情況及其與臨床病理參數的關系。

綜上所述，LC3B 亞型蛋白可能是PTC 患者的一個潛在靶點，在后期研究中應考慮大樣本驗證，以明確LC3B 蛋白作為判斷甲狀腺良惡性腫瘤的生物標記物的可行性；同時，應結合免疫組織化學技術，綜合判斷LC3A、LC3B 蛋白強度以及LC3B/LC3A 比值與其他臨床病理參數的關系。