參苓白術(shù)顆粒對膿毒癥大鼠的保護作用及對肺水代謝的影響*

巫莉萍 薛小燕 溫建東

膿毒癥是感染、創(chuàng)傷等誘發(fā)劇烈全身性炎癥反應(yīng)，引起組織器官繼發(fā)性損傷的臨床癥候群，膿毒癥休克是重癥監(jiān)護患者最常見的死亡原因，死亡率高達20%～80%[1]。肺是膿毒癥最易受影響的靶器官，肺損傷往往最早出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)肺損傷往往預示預后不佳[2]。急性肺損傷是各種直接或間接因素引起肺泡上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫、急性低氧性呼吸功能不全等[3]。臨床證實，肺水清除率高的膿毒癥患者，需要呼吸機支持治療的時間相對縮短，病死率降低[4]。本研究主要探討具有補益脾肺之氣和利水滲濕作用的參苓白術(shù)顆粒對膿毒癥大鼠的保護作用以及對肺水代謝的影響，證實免疫增強對膿毒癥治療有效，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥大鼠模型 該研究起止時間為2017 年1 月-2019 年4 月，選擇6～8 周齡健康雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量200～230 g，由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供，經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后備用。將40 只大鼠隨機分為對照組、模型組、參苓白術(shù)預防組和治療組，每組10 只，參苓白術(shù)顆粒購自云南騰沖制藥廠。

1.2 方法 對照組手術(shù)切開后在縫合，模型組構(gòu)建膿毒癥模型，預防組在造模前即應(yīng)用參苓白術(shù)灌胃處理，治療組在造模后才應(yīng)用參苓白術(shù)灌胃處理。采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）復制膿毒癥模型：術(shù)前禁食12 h，烏拉坦（1 250 mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠仰面固定，中下腹取4 cm×4 cm 面積備皮，常規(guī)消毒，沿腹正中線做3 cm 長切口，沿腹白線分離肌層切開腹膜進入腹腔，游離腸系膜和盲腸，以手術(shù)絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，用21 號針頭在結(jié)扎端貫通穿刺1 次，擠出糞便少許，還納腸段，依次縫合腹膜和皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)面。

1.3 觀察指標和檢測方法

1.3.1 肺組織病理觀察 （1）大體觀察：麻醉后剪開胸腔完整取出雙側(cè)肺葉，濾紙吸干表面血跡，肉眼觀察肺臟的形態(tài)變化。（2）病理學HE 染色及評分：取左肺放于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯浸透、石蠟包埋、5 μm 厚切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、HE 常規(guī)染色、封片后光鏡觀察肺組織病理變化。每一標本由同一位病理醫(yī)生根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎細胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成和肺不張改變共6 個項目，按無、輕、中、重分別計0、1、2 和3 分，各項相加總分0～18 分，分值越高，肺損傷越重。（3）肺濕重/干重比值（W/D）測定：開胸后取右肺上葉，生理鹽水漂洗，濾紙吸干表面液體稱濕重，經(jīng)70 ℃烘箱烘烤48 h 后稱干重，計算W/D，剩余標本置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肺組織AQP-1 mRNA 含量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈（qRT-PCR）法檢測，結(jié)扎右主支氣管，剪右中肺組織，立即置于液氮罐中-180 ℃保存，組織研磨后用Trizol 抽提組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計、瓊脂糖電泳檢測RNA 純度和完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（takara，Code NO.RR036A）說明書合成cDNA。參照SYBRPremix Ex TaqTM 試劑盒說明書建立20 μL 反應(yīng)體系，其中2μL cDNA為模板擴增，肌動蛋白β-actin 為內(nèi)參照，利用PCR 儀擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s 變性，95 ℃5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環(huán)。樣品管和內(nèi)參管均設(shè)3 個復管，反應(yīng)結(jié)束后，ABI7300 SDS Software 自動分析熒光信號轉(zhuǎn)換CT 值，CT 值取3 個復管的平均值。△CT 為目的基因CT 值與內(nèi)參CT 值的差值，以2-△△CT法計算目的基因與內(nèi)參基因熒光的比值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差齊性分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織大體觀察水腫和出血嚴重，半定量評分升高，W/D 值增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，預防組和治療組評分降低，W/D 值下降，并且預防組比治療組評分降低，W/D 值下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺組織病理比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織病理比較（±s）

*與對照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；△與治療組比較，P＜0.05。

2.2 各組大鼠肺組織AQP-1 mRNA 表達比較 對照組、模型組、預防組和治療組AQP-1 mRNA 表達分別為（0.36±0.09）、（0.75±0.19）、（0.42±0.11）、（0.56±0.14），與對照組比較，模型組大鼠肺組織AQP-1 mRNA 表達增加（t=32.236，P＜0.001）；與模型組比較，預防組和治療組AQP-1 mRNA 表達均減少（t=-26.532、-15.234，P＜0.001）；并且預防組比治療組AQP-1 mRNA 表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=-13.236，P＜0.001）。見圖1。

圖1 qRT-PCR法檢測肺組織AQP-1 mRNA表達

3 討論

大量研究證明，單一對膿毒癥進行抗炎而忽視免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是不夠的[5]。與非膿毒癥死亡患者相比，膿毒癥死亡患者存在明顯的免疫抑制表現(xiàn)，免疫強化治療可改善臨床療效[6]。膿毒癥的病程進展迅速，早期非常短，一般不易發(fā)現(xiàn)，入院時多處于中晚期，此時機體經(jīng)歷臟氣受損、正邪相爭的階段，很快進入臟氣衰敗階段。這一轉(zhuǎn)變過程相當于西醫(yī)提出的膿毒癥誘因到膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）到多器官功能障礙綜合征（MODS）[7]。幾乎所有膿毒癥患者均可見正氣不足之征，疾病越重氣虛越明顯，甚至形成陽氣虧損、陰竭陽脫等危急癥候。

從《內(nèi)經(jīng)》陰陽的關(guān)系來看，嚴重膿毒癥開始以應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)作為機體的保護機制，類似中醫(yī)所說的正氣奮起抗邪，屬于實證。但應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過度則引起機體應(yīng)激和免疫失衡，類似中醫(yī)的陽勝則陰衰，從而出現(xiàn)急性陰陽失衡的狀態(tài)，嚴重膿毒癥在進展過程中常出現(xiàn)免疫麻痹，類似中醫(yī)正氣無力抗邪的急性虛證，表現(xiàn)“邪毒熾盛，正氣已虛”之本虛標實的病機特點[8]。所以，中醫(yī)認為膿毒癥發(fā)病多由邪毒入侵（嚴重感染）損傷正氣，故正虛邪盛貫穿于膿毒癥發(fā)病的全過程[9]。

現(xiàn)代醫(yī)學在邪盛方面的治療具有明顯優(yōu)勢，例如廣譜抗菌藥物、外科手術(shù)、呼吸機、床邊連續(xù)性腎臟替代治療（CRRT）等，是中醫(yī)始終難以超越的[10]。現(xiàn)代醫(yī)學在增強機體自身抵抗力方面非常有限，效果欠佳；而中醫(yī)在扶正方面可謂得心應(yīng)手，在正虛方面大有作為。扶正包括陽（氣）、陰（血）兩個方面，中醫(yī)認為“有形之血不可速生，無形之氣所當速固”。現(xiàn)代醫(yī)學通過大量補液、輸血、輸人蛋白而使血（陰）受損迅速得到糾正，但氣（陽）受損難以用現(xiàn)代手段短時間內(nèi)恢復[11]。中醫(yī)《內(nèi)經(jīng)》認為正氣內(nèi)虛是所有疾病的根本原因，也是膿毒癥發(fā)病的根本原因[12]。《內(nèi)經(jīng)》云：“陰平陽秘，精神乃治，陰陽離決，精氣乃絕。”說明機體正氣充足，陰陽調(diào)和，則疾病痊愈，可恢復健康；若陰陽受損進而離絕，則生命消逝。所以扶助陽氣就成為中醫(yī)治療膿毒癥的重點，也是中西醫(yī)結(jié)合治療膿毒癥的切入點[13]。

既往中醫(yī)治療膿毒癥多從毒瘀入手，近年來，扶正逐漸成為膿毒癥治療的熱點。益氣扶正，可以補氣通陽，使陽氣暢達，通過整體調(diào)節(jié)，發(fā)揮機體本身的抗病能力，促進內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，達到“各安其氣，必清必靜，則病氣衰去，歸其所宗”[14]。因此，中醫(yī)強調(diào)補氣在膿毒癥治療中的重要作用是基于中西醫(yī)結(jié)合取兩者之長，在現(xiàn)代西醫(yī)急救手段的配合下，發(fā)揮中醫(yī)的優(yōu)點，整體調(diào)節(jié)，提高機體本身的抗病能力，促進內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，爭取達到最佳療效，提高治愈率，降低病死率[15]。

通過該研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠肺組織大體觀察水腫和出血嚴重，半定量評分升高，W/D 值增加，AQP-1 mRNA 表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，預防組和治療組評分降低，W/D 值下降，AQP-1 mRNA 表達減少，并且預防組比治療組評分降低，W/D 值下降，AQP-1 mRNA 表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。參苓白術(shù)散藥性味平和，由人參、茯苓、白術(shù)、山藥、白扁豆、蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、炙甘草組成，具有健脾益氣，利水滲濕之功效[16]。研究發(fā)現(xiàn)，對非酒精性脂肪性肝病的防治療效顯著；對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，如脾虛泄瀉小鼠模型和環(huán)磷酰胺誘導小鼠免疫抑制動物模型，能顯著增強其免疫功能；增加或減少腸道細菌數(shù)量，恢復腸道菌群平衡，保護腸道黏膜組織，雙向改善胃腸動力，治療胃動力不足或腹瀉[17-18]。中醫(yī)理論認為，肺主通調(diào)水道，屬“金”，脾主運化水濕，屬“土”，脾肺互為母子關(guān)系，通過培土生金既可補益脾肺之氣達到免疫強化之功，又能促進水液的正常代謝。參苓白術(shù)顆粒具有健脾益氣之效、桔梗可引藥上行，取培土生金之意增強免疫力；茯苓、薏苡仁、砂仁兼有化濕利水之效，可促進肺水代謝[19]。

綜上所述，參苓白術(shù)顆粒能夠降低膿毒癥肺損傷嚴重程度，抑制肺組織AQP-1 表達，改善肺水代謝，并且預防性應(yīng)用較治療效果更突出。該研究創(chuàng)新之處為目前還未見有參苓白術(shù)顆粒在膿毒癥中的應(yīng)用報道，更未見從肺水代謝方面研究其保護機制，通過該研究既能證實“免疫強化對膿毒血癥有效”這一理論，為拓展膿毒癥的藥物治療提供實驗依據(jù)，為患者帶來更佳的治療效果，又能進一步闡明參苓白術(shù)顆粒對膿毒癥的保護機制是否與影響肺水代謝有關(guān)。