hsa_circ_087631在原發性膽汁性膽管炎中的表達和作用機制*

張吟眉，郝新杰，鄭佳佳

（北京大學第三醫院檢驗科，北京 100191）

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangi?tis，PBC）是一種漸進性發展的慢性自身免疫性膽汁淤積性肝病，以淋巴細胞性膽管炎，肝內小膽管逐漸破壞，導致纖維化為主要特征，并可能通過并發癥導致肝硬化［1］。PBC 發病機制復雜，目前臨床尚缺乏PBC 早期診斷理想的分子標志物以及監測PBC 疾病進展以及治療效果的有效指標［2-3］。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類共價閉合的非編碼RNA 分子，具有較高的核糖核酸酶R（ribonuclease R，RNase R）抗性和較長的半衰期，并以組織和發育階段特異性方式表達［4-5］。circRNA 具有生物調控功能，可以作為微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的分子海綿以調控miRNA 對靶基因表達的干預，是一種潛在的理想的疾病診斷標志物和治療靶標［6-7］。我們前期分析了PBC 患者circRNA 表達譜芯片，發現22 條差異表達的circRNA，hsa_circ_087631 是其中豐度較高且表達均一的circRNA 之一［8］。通過芯片生物信息學分析獲得與circRNA 結合的miRNA，并對miRNA 靶基因進行預測，顯示在hsa_circ_087631 與miR-346 上存在結合位點。為揭示hsa_circ_087631 和miR-346 是否參與PBC 的發病機制，我們觀察了hsa_circ_087631 在PBC 患者中的表達，并初步探討了其作用機制。

前期我們通過文獻檢索聯合芯片和RT-qPCR 檢測，證實了miR-346在PBC 患者外周血T淋巴細胞的表達顯著低于健康對照組。有研究表明，濾泡輔助性T 細胞（follicular helper T cells，Tfh）和濾泡調節性T細胞（follicular regulatory T cells，Tfr）的比例失衡可以導致多種自身免疫性疾病［9-10］。本課題組的前期研究發現，PBC患者相對于健康者Tfh細胞比例顯著升高，Tfr 細胞比例下降［11］。有文獻報道，Tfh17 和Tfh2 能夠通過分泌白細胞介素21（interleukin-21，IL-21）輔助B 細胞產生免疫球蛋白［12］；又有文獻表明，miR-346能通過抑制Bcl-6，調控自身免疫性疾病中循環CD4+CXCR5+Tfh 細胞的比例［13］。因此，我們試圖研究在PBC 患者中是否存在hsa_circ_087631/miR-346/Bcl6 或hsa_circ_087631/miR-346/IL-21 的 信號轉導，通過調控CD4+CXCR5+Tfh 細胞參與PBC 的進展，以及對預測的circRNA-miRNA-mRNA 通路的潛在功能進行探索，為探索PBC 新的靶向治療方法提供依據。

材料和方法

1 隊列收集

實驗對象為2018 年～2019 年北京大學第三醫院消化科門診和住院PBC 患者30 例，以及性別、年齡匹配的健康對照者30 例。所有入組個體均進行肝功能、抗線粒體抗體（antimitochondrial antibodies，AMA）、免疫球蛋白及肝臟B 超檢測，并排除HBV 和HCV 感染，隊列的臨床特征見表1。所有患者及健康對照者全部填寫知情同意書。所有個體采集外周靜脈抗凝血進行后續檢測。

表1 PBC患者和健康對照者的臨床特征Table 1.Clinical characteristics of PBC patients and healthy controls

2 主要試劑

TRIzol 和Lipofectamine 2000（Invitrogen）；逆轉錄試劑盒、SYBR Green Mix、SDS loading buffer 和RNase free water（TaKaRa）；DMEM/F12培養基、胎牛血清、Opti-MEM?I Reduced Serum Medium 和0.25%EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；Polyethylenimine MAX（Polysciences）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）；所用引物由上海生工公司合成，序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 主要方法

3.1 構建過表達hsa-miR-346 的慢病毒pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS 將hsa-miR-346 模板DNA 定向插入慢病毒pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Pu?ro-CMV-MCS 載體（記為H145）中，構建過表達hsamiR-346 的慢病毒 pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（記為H9113），并轉染到293TN細胞中。

3.2 RT-qPCR 實驗 采用TRIzol 法從細胞中提取總RNA，取1.0 μg 總RNA，用oligo（dT）和random primers 逆轉錄出cDNA 用于檢測hsa-miR-346、hsa_circ_087631、Bcl-6 mRNA 和IL-21 mRNA 表達水平。以GAPDH 為內參照。在ABI PRISM?7500 Se?quence Detection System（Applied Biosystems）進行PCR和數據分析。以2?ΔΔCt法計算相對表達水平

3.3 雙螢光素酶報告基因系統檢測hsa_circ_087631 與hsa-miR-346 的結合 參照已報道方法構建包含hsa-miR-346 潛在結合序列的hsa_circ_087631 重組螢光素酶報告質粒pGL3-hsa_circ_087631-761-781 及包含突變了結合序列的重組質粒pGL3-hsa_circ_087631-761-781-Mut。將293T細胞按70%的匯合度接種到96 孔板，24 h 后轉染螢光素酶報告基因質粒和miRNA，每個樣品設置6 個復孔，轉染48 h后，棄去培養基，用PBS緩沖液洗滌細胞1次。每孔加入50 μL 的1× Passive Lysis Buffer 裂解液，常溫條件搖床晃動15 min；裂解液轉移到白色不透光的96 孔酶標板中，加入100 μL 預先混好的LAR II，設置熒光發光儀程序，檢測螢火蟲螢光素酶的活性；向檢測管中加入100 μL Stop&Glo?試劑，檢測海腎螢光素酶活性。兩種螢光素酶活性比值的變化可反映hsa_circRNA_08763與hsa-miR-346結合情況。

4 統計學處理

計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，用SPSS 20.0 統計軟件進行分析。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 PBC患者外周血hsa_circ_087631水平顯著升高

本研究選取30 例PBC 患者和30 例健康對照者血漿標本進行檢測，結果顯示，PBC 患者的hsa_circ_087631 水平與健康對照者相比顯著升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The expression of hsa_circ_0087631 in the peripheral blood from PBC patients and healthy controls was de?tected by RT-qPCR.Mean±SD. n=30.*P＜0.05 vs healthy control group.圖1 PBC 患者和健康對照者外周血hsa_circ_0087631 表達水平的比較

2 hsa-miR-346 在Jurkat 細胞過表達后hsa_circ_0087631表達降低

通過芯片生物信息學分析，我們發現在PBC 外周血中高表達的hsa_circRNA_087631 與miR-346 存在結合位點。接下來我們驗證兩者是否存在調控作用。將目的基因hsa-miR-346 插入空載體pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（H145），成功構建hsa-miR-346 過表達的慢病毒pLenti-EF1a-EGFPF2A-Puro-CMV-MCS（H9113），見圖2A。該慢病毒感染293TN 細胞的效果如2B 所示，H9113 能夠穩定過表達hsa-miR-346，見圖2C。將該慢病毒以MOI=60感染人急性T細胞白血病Jurkat細胞后，與空載體對照Jurkat-H145 組相比，轉染H9113 的Jurkat-H9113 組中hsa-miR-346 的表達水平顯著增高（P＜0.01），而hsa_circ_087631 的表達水平降低（P＜0.01），見圖2D、E。

Figure 2.The expression of hsa_circ_0087631 was decreased after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector was transfected into the Jurkat cells.A：the structural diagram of blank vector pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（H145）and hsamiR-346-overexpressing lentiviral vector pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（H9113）；B：the cell infection rate of H145 and H9113（48 h after transfection，×200）；C：the expression of hsa-miR-346 in 293TN cells after transfection；D：the expression of hsa-miR-346 after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector H9113 was transfected into the Jurkat cells；E：the expression of hsa_circ_087631 after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector H9113 was transfected into the Jurkat cells.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs H145 group；**P＜0.01 vs Jurkat-H145 group.圖2 hsa-miR-346過表達慢病毒降低Jurkat細胞中hsa_circ_0087631表達

3 hsa-miR-346對Bcl-6和IL-21的調控

我們進一步驗證miR-346 是否對下游靶基因Bcl-6和IL-21存在調控。將hsa-miR-346 過表達慢病毒質粒H9113 以MOI=60 感染Jurkat 細胞后，Jurkat-H9113 組Bcl-6 和IL-21 的mRNA 表達均顯著降低（P＜0.05），見圖3。這提示hsa-miR-346 對下游基因Bcl-6和IL-21存在調控作用。

4 驗證hsa_circ_0087631與hsa-miR-346的相互作用

我們通過雙螢光素酶報告基因系統檢測hsamiR-346和hsa_circ_087631是否存在相互作用，再結合定點突變技術確定miRNA 與靶基因的作用位點。構建hsa_circ_087631 野生型質粒（pMIR-REPORThsa_circ_087631 3′UTR-WT，H7168）和hsa_circ_087631 雙突變質粒（pMIR-REPORT-hsa_circ_087631 3′UTR-Mut，H7169），其中hsa_circ_087631雙突變位點針對生物信息學預測的hsa-miR-346 與hsa_circ_087631 結合的兩個靶位點進行突變，見圖4A。將H7168 及H7169 分別與hsa-miR-346 mimics共轉染至293T 細胞，hsa-miR-346 可顯著降低野生型hsa_circ_087631 的螢光素酶活性（P＜0.01）；而在結合位點突變后，這種調控關系仍然存在（P＜0.01），見圖4B。由此推測該miRNA 可能不是通過我們預測的結合位點調控了螢光素酶的表達。上述結果證實hsa_circ_087631 與hsa-miR-346 的確存在相互作用，hsa-miR-346 抑制了hsa_circ_087631 的表達，但結合位點需要進一步通過實驗驗證。

Figure 3.The mRNA expression of Bcl-6 and IL-21 after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector was transfected into the Jurkat cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Jurcat-H145 group.圖3 hsa-miR-346過表達對Jurkat細胞中Bcl-6和IL-21表達的影響

Figure 4.Dual-luciferase reporter assay was performed to identify the interactions between hsa_circ_087631 and hsa-miR-346.A：the schematic diagram of double mutant hsa_circ_087631 vector（H7169）；B：relative luciferase activity in dual-luciferase reporter assay.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs H7168+NC group；##P＜0.01 vs H7169+NC group.圖4 雙螢光素酶報告基因實驗驗證hsa_circ_0087631與hsa-miR-346的相互作用

討 論

PBC 是一種慢性膽汁淤積性自身免疫性疾病，可進展為終末期肝病，其發病機制復雜，目前臨床尚缺乏PBC 早期診斷理想的分子標志物以及監測PBC疾病進展和治療效果的有效指標［15］。

circRNA 是一類具有調控基因表達作用的特殊的內源性非編碼RNA，在進化上高度保守［5］，與線性的mRNA 相比有更好的穩定性。circRNA 在外周血中穩定存在，參與免疫細胞發育和免疫調節的多個階段，不僅可以作為診斷人類自身免疫性疾病的生物標志物，還可以代表疾病的活動性或嚴重程度。miRNA 是一種內源性的小分子非編碼RNA，廣泛參與生物體的生長、凋亡等的調控，與多種自身免疫性疾病的發展密切相關，circRNA 可通過作為miRNA的分子海綿調控許多生物學過程，包括DNA 甲基化、免疫反應和炎癥反應，與多種自身免疫性疾病的相關［16-18］。

在前期工作中，我們通過比較PBC 患者及性別年齡匹配的健康對照者外周血血漿中circRNA 表達譜芯片分析以及聚類分析，發現了22 條差異表達的circRNA，其中hsa_circ_087631 是外周血中高表達的circRNA 之一。本研究中我們再次通過RT-qPCR 對芯片結果進行驗證，結果證實hsa_circ_087631 在PBC 患者外周血中相對于健康對照者表達升高。將hsa-miR-346過表達慢病毒感染人急性T細胞白血病Jurkat 細胞后，hsa_circ_087631 表達降低，提示hsa_circ_0087631 可能通過調控hsa-miR-346 發揮作用。

Tfh 細胞作為新近發現的效應T 細胞亞群，輔助生發中心B 細胞產生抗體，其調節抗體生成的促生發中心反應可被Tfr 細胞抑制。多種自身免疫病的發生與Tfr 細胞分化不足、Tfh 數量增多及Tfr/Tfh 比值失衡有關［19-20］。本課題前期研究結果發現PBC 患者相對于健康者Tfh 細胞比例顯著升高，Tfr 細胞比例下降，Tfr/Tfh比值顯著降低［11］。

Chen（陳娟）等［13，21］報道了miR-346 對Bcl-6 有調控作用，而黃勇武等［22］的研究表明IL-21 可能通過調節Th17/Treg 平衡而參與了PBC 的發病機制。IL-21 可介導多種生物學效應的細胞因子，主要由活化的CD4+T 輔助細胞等合成和分泌，同時也可促進Tfh17 和Tfh2 分化、B 細胞轉化為漿細胞以及免疫球蛋白的分泌，與多種自身免疫性疾病發病有關［22-23］。Bcl-6 主要表達于生發中心的B 細胞和CD4+T 細胞，參與調節T 細胞依賴的抗原反應。有研究顯示miR-346 在PBC 患者外周血T 細胞中顯著低于健康者，并可能參與了PBC 的發病過程［24］，其機制可能是通過在轉錄水平和翻譯水平抑制Bcl-6，從而調控自身免疫病中循環CD4+CXCR5+Tfh 細胞的表達情況［13］。本研究中，將hsa-miR-346 過表達慢病毒感染Jurkat細胞后，Bcl-6和IL-21的mRNA表達均顯著降低。這提示在人T 細胞中可能存在hsa_circ_0087631/hsamiR-346/Bcl-6 或hsa_circ_0087631/hsa-miR-346/IL-21 功能關聯的調控。hsa_circ_0087631 可能通過下調hsa-miR-346，調控下游靶基因Bcl-6和IL-21，上調Tfh細胞比例，從而在PBC的發病過程中發揮作用。

接下來，我們通過雙螢光素酶報告基因系統研究hsa-miR-346 與hsa_circ_087631 的相互作用，并結合定點突變技術確定miRNA 與靶基因的作用位點。將野生型及雙突變的hsa_circ_087631 質粒分別與hsa-miR-346 mimics 共轉染至293T 細胞后，hsa-miR-346 可顯著降低野生型hsa_circ_087631 的螢光素酶活性，而在結合位點突變后，這種調控關系仍然存在。上述實驗結果證實了hsa-miR-346 與hsa_circ_087631 之間存在特異結合作用，但可能不是通過我們預測的結合位點調控螢光素酶的表達。在下一步的實驗中，我們將應用多數據庫，交叉預測hsa-miR-346 與hsa_circ_087631 之間的作用位點，繼續探明hsa_circ_087631在PBC中作用的確切分子機制。

綜上所述，本研究探索了參與自身免疫病理進程重要的Tfh 細胞相關的circRNA 在PBC 中的表達及其與上下游調控分子相互作用的機制。此類研究在國內外尚無報道，在相關研究領域屬于首創，具有一定的創新性和科學價值，為探索PBC 新的靶向治療方法提供理論依據。本研究也存在一定局限性，circRNA 可能影響的潛在下游靶基因對細胞功能的作用以及circRNA 與miR-346 的正確結合位點還有待進一步深入研究。