microRNA在骨組織修復中的研究進展

任航，閆景龍

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨六科，黑龍江 哈爾濱 150081)

目前，由創傷、炎癥或腫瘤切除導致的大節段性骨缺損及復雜類型骨折的治療仍是骨科領域面臨的難題[1]。骨組織的延遲愈合或不愈合不僅給患者帶來長期疼痛，影響其生活質量，還會因反復的手術治療增加經濟負擔，甚至導致患者死亡率升高，因此尋求一種提高骨組織修復質量和速度的治療策略尤為重要。除傳統手術治療外，近年來人們還研究了骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生長因子等[2]生物療法，以及磁場和低強度脈沖超聲等[3]物理療法，盡管這些療法在一定程度上促進了骨組織修復，但均無法取得滿意的治療效果。已有研究表明[4]，微小RNA(micro-RNA，miRNA)作為一種調節基因表達的小型非編碼RNA，對于骨、軟骨和肌肉組織的發育和穩態至關重要，在骨組織修復過程中表達水平顯著改變，有望成為復雜類型骨折、骨缺損等疾病治療的新靶點。本文簡要描述了miRNA的生物合成、成骨調控功能以及在骨折、骨缺損的研究現狀，并且探討了miRNA作為骨組織修復潛在的靶點。

1 miRNA在生物體內的合成

miRNA是一種非編碼的單鏈RNA，在基因表達中起轉錄后調控作用。miRNA基因在基因組的基因間隔區呈聚集存在，因此它們能夠轉錄成多順反子轉錄產物[5]。miRNA的轉錄過程在細胞核內開始[6]：(1)最初由RNA聚合酶Ⅱ生成含有初級轉錄物(pri-miRNA)莖環結構；(2)然后經由核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)Drosha酶與dsRNA-結合區域蛋白DGCR8形成的多蛋白復合體加工，形成發夾環結構的前體miRNA(miRNA precursor，pre-miRNA)；(3)由內含子編碼形成的pri-miRNA經剪接體處理后，同樣生成pre-miRNA；(4)這兩種pre-miRNA通過Ran-GTP依賴機制進入細胞質；(5)經細胞質內Dicer酶和反式激活效應元件RNA結合蛋白(TAR RNA binding protein，TRBP)加工形成長度19～25個核苷酸的雙鏈成熟miRNA，隨后雙鏈展開形成單鏈miRNA；(6)單鏈miRNA被加載到Argonaut蛋白上，與Dicer酶共同形成RNA誘導沉默復合體；(7)miRNA與目標miRNA上的3'-非翻譯區域(3’untranslated regions，3’UTR)完全結合則誘導目標miRNA的降解，不完全結合則抑制其翻譯，從而抑制蛋白質合成達到目標基因的沉默。

2 miRNA在成骨中的調控作用

成骨的過程主要涉及BMP及Wnt/β聯合蛋白信號通路。BMP與細胞表面I型和Ⅱ型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體結合，引起信號轉導因子Smad磷酸化，形成Smad復合體，激活成骨特異性轉錄因子Dlx5，引起Osx和Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨特異轉錄因子的表達，誘導成骨分化[7]。與BMP信號通路相似，Wnt/β聯合蛋白信號通路通過上調Runx2誘導成骨分化，此外BMP2還能刺激Wnt配體轉錄，抑制β-TrCP，協同Wnt/β聯合蛋白信號通路促進成骨[8]。Zhang等[9]證明miR-93-5p與BMP-2的RNA3’ UTR不完全配對結合，通過抑制BMP-2的表達從而調控成骨分化。Fang等[10]研究證明miR-106b-5p及miR-17-5p能夠靶向抑制Smad5，從而抑制BMP-2的產生及成骨分化，而使用這兩種miRNA的拮抗劑，能提高Smad5的mRNA以及ALP、Runx2等成骨活性標記物的水平。Laxman等[11]研究結果表明，miR-203和miR-320b通過抑制Dlx5及其下游信號通路來抑制BMP誘導的成骨分化。Fan等[12]研究發現，miR-450b能結合成骨抑制因子BMP-3的3’UTR區，抑制其表達，促進成骨分化。Luo等[13]發現let-7i-3p通過負調節淋巴增強因子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF1)，抑制Wnt/β聯合蛋白通路的表達從而抑制成骨分化。Tang等[14]發現miR-433-3p能夠與Wnt信號通路的拮抗劑分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK1)miRNA的3’UTR結合，抑制其翻譯，增強Wnt/β連環蛋白信號通路，促進成骨分化。綜上所述，在成骨過程中micro-RNA通過調節BMP或Wnt/B連環蛋白信號通路中的相關因子，最終影響Runx2的表達，這是micro-RNA在成骨分化發揮作用的條件之一。

3 miRNA與骨折修復

3.1 miRNA在骨折后的表達 骨折的修復是一個連續的動態過程，包括血腫機化、原始骨痂形成和骨痂改造塑形三個階段，micro-RNA的表達水平在這一過程發生顯著變化[15]。Yavropoulou等[16]采用病例對照方法研究了循環miRNA與絕經后婦女低骨密度椎體骨折的聯系，總共納入了100名絕經后婦女進行研究，包括35例低骨密度且椎體骨折的患者、35例低骨密度不伴有骨折的患者以及作為對照組的30例健康人。通過檢測血清樣本中分離出的14種miRNA的表達水平，發現與對照組相比低骨密度患者血清miR-124、miR-2861顯著升高，miR-21、miR-23和miR-29顯著降低，進一步分析顯示miR-21-5p在骨折患者血清樣本中表達顯著降低。研究人員不僅在患者血清樣本中發現了異常表達的miRNA，還在患者的骨組織中發現了同樣的現象。在另一臨床研究中，De-Ugarte等[17]比較了因骨質疏松骨折(n=6)及骨關節炎(n=6)進行髖關節置換獲得的新鮮股骨頸骨小梁組織中的miRNA的表達。該研究采用miRNA陣列分析和聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術，發現miR-320a和miR-483-5p在骨質疏松骨折中顯著表達。值得注意的是這兩項研究存在一定的局限性，二者均采用的是骨質疏松骨折患者的樣本，并非是健康人群骨折的樣本，因此需要考慮骨質疏松對miRNA的影響。除了上述臨床研究外，一些國內外學者還進行了動物骨折模型的miRNA分析研究。Hadjiargyrou等[18]首次報道了小鼠骨折修復早期的miRNA轉錄組，研究人員利用小鼠股骨單側骨折模型，通過將骨折早期的愈傷組織及健側骨組織分離出的miRNA與小鼠miRNA基因芯片雜交，發現與健側骨組織相比，愈合組織中存在306個表達上調的miRNA，374個表達下調的miRNA，另有20個miRNA同時表達上調和下調。miRNA在骨折后表達水平發生顯著改變，通過血清提取miRNA具有簡便快捷的優點，隨著檢測技術的發展，miRNA能夠成為骨折早期診斷及病情監測的新靶點。

3.2 miRNA在骨折的治療研究 存在于骨髓及結締組織中的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)，具備分化骨、軟骨、肌肉等多種細胞系的潛能。最近一些研究表明，miRNA的表達與骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)分化成特定譜系有關。Shi等[19]將轉染了miR-218 BMSC局部注射至小鼠股骨骨折部位，通過micro-CT及組織學免疫組化等方式發現miR-218能夠改善新骨形成，加速骨折愈合。Lee等[20]將載有miR-29b-3p質粒轉染BMSC注射至小鼠股骨骨折部位，觀察其對骨折愈合的影響，發現單次注射治療可以顯著提高骨密度增加骨體積分數，而重復的注射無法增加治療效果。然而促進骨折愈合是否是miRNA的普遍功能仍然存在爭議。

miRNA還可以作為祖細胞向成骨細胞分化的負調控因子。Yao等[21]發現小鼠成骨細胞中miR-185的表達增加與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、Wnt5b、β-連環蛋白表達減少有關，提示miR-185可能通過靶向PTH阻斷Wnt/β-連環蛋白通路抑制成骨細胞生長和增殖，對成骨產生負向調節作用。Liu等[22]研究發現miR-155的過表達可以抑制裸鼠皮下間充質干細胞的異位成骨，基因檢測顯示在這一過程中miR-155能夠通過抑制骨形態發生蛋白受體9，從而降低成骨相關基因的表達。這些研究結果表明miRNA作為內源性的轉錄后調節因子，對骨組織再生至關重要。基于miRNA的基因療法對于復雜性骨折的治療有很大潛力，仍需要進一步的體內研究來探索miRNA在骨折修復過程中各時間段的確切作用。

4 miRNA與骨缺損修復

4.1 miRNA與成骨-成血管耦聯 一項系統綜述[23]結果表明，miRNA通過調控新血管的生成促進骨缺損修復。骨缺損的發生常伴隨著血管損傷，造成局部的缺血、缺氧，影響營養物質及干細胞的運輸，導致支架材料在植入的最初階段發生細胞死亡，引起最終的骨缺損修復的失敗或延遲愈合。Ramasamy等[24]研究發現，在小鼠骨組織中存在一種對CD31強陽性的內皮細胞，具有介導血管周圍骨祖細胞分化的功能。Yang等[25]采用miRNA微陣列分析，發現在CD31 hiEmcnhi內皮細胞中miR-497～195簇表達水平顯著升高。研究人員通過尾靜脈將構建的aptamer-agomiR-195注射至WT小鼠體內，在3個月后發現CD31 hiEmcnhi內皮細胞及成骨細胞數量成倍增加，且骨小梁的數目、體積及厚度均增高。Zhang等[26]的研究表明，提高miR-378表達能夠增強BMSC成骨分化，發現轉染miR-378的BMSC顯著增加了Runx2、BMP-2、骨鈣素(osteocalcin，OCN)等成骨基因及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和Ang-1等血管生成基因的表達水平。體外培養14d后采用基底膜基質血管造影法，發現新生血管的分支數量和長度顯著高于陰性對照組。Zhang等[26]的研究結果提示miR-378可作為成骨-成血管耦合的理想靶點。此前，Eskildsen等[27]的研究已經證明antimir-138通過增強細胞外調節蛋白激酶1/2磷酸化水平以及Runx2的表達促進MSC成骨分化。Yan等[28]通過體外研究發現antimir-138能夠促進MSC的VEGF的表達。研究人員利用antimir-138轉染MSC薄片，將其包裹在鈦棒表面并植入小鼠皮下。體內植入實驗結果顯示，8周后在含有antimir-138植入體的周圍形成大量新生骨并且含有豐富的新生血管。以上研究結果表明，miRNA積極參與成骨-成血管耦聯的調控，具有促進骨組織修復的治療潛力，但仍需要進一步研究其確切機制。

4.2 miRNA與骨科支架材料 miRNA在大塊骨缺損的治療中具有促進組織修復作用。目前臨床上針對骨缺損的治療包括自體骨移植、異體骨移植和人工骨移植，其中自體骨移植被認為是骨缺損修復的黃金標準，但是其臨床應用常常受到供體部位的限制，因此近年來生物支架材料作為自體骨修復重建的一種替代方法受到人們的關注[29]。研究[30]發現將BMP等促進成骨的細胞因子聯合支架材料能夠誘導新骨形成，但是這些外源性細胞因子在體內半衰期短，易被快速降解，無法起到持續調控作用。而miRNA能夠內源性的促進骨組織自身分泌信號，產生成骨相關細胞因子，實現大塊骨缺損部位的愈合。Yang等[31]研究發現，用表達miR-21的間充質干細胞復合β-TCP材料對顱骨缺損大鼠進行治療后，缺損部位新骨形成及礦化的體積和P-AKt及HIF-1α表達水平顯著高于不含miR-21支架的對照組，而PTEN的表達水平降低，提示這一過程可能與miR-21基因靶向激活PTEN/PI3K/AKT/HIF-1α信號傳導途徑相關。Yuan等[32]將轉染了antimiR-26a-5p的脂肪干細胞聯合雙相磷酸鈣支架用于大鼠股骨缺損的治療，可在第8周修復骨缺損并提高了骨密度及骨小梁的數量。Zhang等[33]合成了一種包裹miR-26a的聚乳酸微球，并將這些微球鏈接到脫細胞納米纖維聚合物支架上，在空間和時間上控制miR-26a的釋放，從而持續激活內源性干細胞修復骨缺損。總之miRNA聯合支架材料的應用可以更快的錨準特定組織，實現對局部組織傳遞治療，未來還需要深入研究支架材料的構建，從而精準的控制miRNA釋放，為骨缺損的治療提供新的策略。

5 總結與展望

隨著轉錄組學的發展，對于miRNA的研究越來越受到關注。目前已經證明miRNA在骨折發生后表達水平顯著改變，其潛在機制可能是通過調控成骨相關基因的表達影響骨折愈合[34]。此外一些特殊的miRNA還能夠促進VEGF等血管生成基因表達，在成骨-成血管耦聯中發揮積極作用。但是miRNA能夠參與多靶點的調控，體內應用時可能發生脫靶效應導致骨以外的組織發生不良反應，未來仍要深入研究如何特異性的傳遞miRNA達到特定的細胞和分子靶點，這有助于研發更好的骨組織修復的治療策略。作者認為當前miRNA在骨組織修復的治療仍處于發展階段，動物模型等實驗結果不足以立即應用于臨床，基于miRNA的診斷和治療有望在未來發揮作用，但亟需更廣泛的實驗研究。