Cu2+、Zn2+脅迫下苦草的生理生化特性研究

江 延 王 巖 賈雨淅 李睿江楊婉秋 姚軍文 高桂青

(1.南昌工程學院 土木與建筑工程學院，江西 南昌 330099；2.南昌工程學院 水利與生態工程學院，江西 南昌 330099)

由于礦產資源的不合理開發利用和人類生活中的胡亂排放，大量重金屬元素進入河流湖泊當中[1-3]，使得水體重金屬含量嚴重超標[4]。重金屬種類和來源各不相同，導致水體污染情況十分復雜[5-6]，因此重金屬污染水體的污染情況也普遍以復合脅迫的形式出現，其中，Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+等都是較為常見的重金屬污染物[7]。研究表明：重金屬對植物體內活性氧代謝系統的平衡起到極其關鍵的作用[8-9]。植物短期內能夠抵抗低濃度的重金屬脅迫，但隨著脅迫時間的延長和重金屬濃度的升高，其生理生長會被嚴重遏制[10]。

苦草是我國大多湖泊的優勢物種，由于其生長繁殖較快、分布較廣，對多種重金屬的富集效果較高，逐漸成為解決重金屬污染問題的先鋒物種[11]。Cu2+、Zn2+都是苦草生長的微量元素，低濃度下能夠促進其發育生長，但高濃度的Cu2+、Zn2+會影響到苦草對其他營養元素的吸收，打破細胞新陳代謝的平衡[12]，進而引發一系列的生理狀況，對苦草的健康狀況產生嚴重的影響。本研究通過Cu2+、Zn2+脅迫下苦草的生理生化特性，探討其響應過程，以期為重金屬污染水體的生態修復提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需的苦草和底泥均采自鄱陽湖。將底泥剔除雜物后，均勻地平鋪在塑料方盒(長34.0 cm、寬22.5 cm、高10 cm)中，底泥厚8 cm。選取葉片健康、長勢健壯的苦草植株，修剪葉片長度為15 cm，根長為3 cm，洗去葉片表面附著物后均勻種植在塑料盒中，每盒12株，然后將塑料方盒放入玻璃缸(長40 cm、寬40 cm、高50 cm)內，加入經過晾曬的自來水至40 cm高度處進行預培養[13]，待植株生長狀況穩定后用于后期實驗。

1.2 實驗設計

向玻璃缸中加入不同濃度的CuSO4、ZnSO4溶液分別進行單一及復合脅迫處理，各設置5個處理組(T1、T2、T3、T4、T5)。Cu2+濃度梯度依次為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L，Zn2+濃度梯度依次為2.0mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L和10.0 mg/L，Cu2++Zn2+復合處理濃度依次為(0.1+1.0)mg/L、(0.2+2.0)mg/L、(0.3+3.0)mg/L、(0.4+4.0)mg/L和(0.5+5.0)mg/L，與此同時，設置濃度為0mg/L的空白對照組(CK)，每個處理組設置3個重復。脅迫培養14d后，進行各項指標的測定。

1.3 測定方法

采用氮藍四唑比色法測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)；采用測定過氧化物酶(Peroxidase，POD)；采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛(Malondialdehyde，MDA)；采用分光光度法測定光合色素。

1.4 數據處理

實驗結果為3次以上平行數據的平均值±標準差，試驗原始數據的處理和制圖釆用Excel2017，用SPSS19.0軟件對數據進行單因素方差分析，采用SNK法進行多重比較分析，P<0.05表示顯著差異。

2 結果與分析

2.1 Cu2+、Zn2+不同脅迫對苦草SOD的影響

Cu2+和Zn2+作為有毒重金屬，對苦草的生理狀況產生了一定的影響。由圖1所知，脅迫培養14d，三種處理方式的T1處理組均小于對照組，當Cu2+濃度為0.2mg/L時，SOD值最低。Zn2+處理下的苦草SOD值始終呈顯著上升趨勢，T5處理組達到最大，對比對照組上升了67.15%，Cu2+單一脅迫的最大值出現在T4處理組為47.35，T5處理組處又呈現明顯的降低現象，說明此濃度的重金屬脅迫已經超出了苦草的承受范圍，對苦草的生長產生一定的抑制性，所以出現先升后降的趨勢。

圖1 不同濃度重金屬脅迫對苦草SOD的影響

Cu2+和Zn2+單一及復合脅迫引起的苦草SOD變化表現出不同的趨勢。整體上看，復合脅迫造成的變化程度更大，且復合脅迫與Cu2+單一脅迫產生的變化規律具有一定的相似性，最大值出現在T4處理組中。T1處理組SOD值與兩種重金屬單一脅迫相差不大，但在較高的濃度中發現，Cu2+脅迫引起的變化幅度最大，其次是復合脅迫，Zn2+脅迫最小。T5階段SOD值降至最低，甚至小于對照組。三種處理方式對苦草的抑制性表現為：Cu2+脅迫>復合脅迫>Zn2+脅迫。

2.2 Cu2+、Zn2+不同脅迫對苦草POD的影響

如圖2所示，Cu2+和Zn2+單一及復合脅迫對苦草POD活性產生顯著的影響(P<0.05)。T1處理組中，三種處理方式的POD值均低于CK組，且酶活性相差不大。隨著重金屬脅迫濃度的升高，Cu2+和Zn2+單一及復合脅迫的POD活性變化趨勢基本相同，T1至T5處理組呈現先上升后下降的趨勢，且均在T4處理階段達到最大，分別為30.47、29.98和36.23，而后又出現不同程度的下降，說明T5處理組的重金屬濃度過高，已經對苦草POD活性產生了抑制作用。

圖2 不同濃度重金屬脅迫對苦草POD的影響

整體上來，兩種重金屬單一脅迫造成的變化相差不大，說明單因素的Cu2+和Zn2+對苦草POD的影響基本相同。復合脅迫的變化幅度較兩種單一脅迫更大，說明對苦草的抑制性最高。

2.3 Cu2+、Zn2+不同脅迫對苦草MDA的影響

苦草MDA含量對Cu2+和Zn2+單一及復合脅迫響應如圖3所示：三種處理的最小值均出現在T1處理組，分別為7.11、6.97和7.01。Cu2+和Zn2+單一脅迫下始終隨濃度的升高而顯著增大(P<0.05)，且兩種處理的變化幅度相差不大，最大值分別為23.67和22.79。

圖3 不同濃度重金屬脅迫對苦草MDA的影響

復合脅迫下的MDA含量隨脅迫濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，T4處理組達到最大，較CK組上升了184.60%，T5處理中又顯著降低，其MDA含量為15.69。三種處理中，復合脅迫對苦草的抑制性最強。

2.4 Cu2+、Zn2+不同脅迫對苦草葉片光合色素含量的影響

葉綠素含量與植物光合作用的能力關系緊密，植物體通過光合作用將體內有機物轉化為能量，太陽光為葉綠素供能將CO2轉化為碳水化合物[14]。本小節從葉綠素含量變化的角度來說明苦草在重金屬脅迫的影響。

三種處理方式的T1處理組葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b均有所增大，可能是由于Cu2+、Zn2+都是苦草生長所需的微量元素，在一定程度上能夠刺激葉綠素的合成，但三種處理的增幅相差不大。隨著重金屬脅迫濃度的升高，葉綠素a+b、葉綠素a含量顯著下降(P<0.05)，而葉綠素b含量變化不顯著。脅迫14d，T5處理組的葉綠素b均達到最低，Cu2+脅迫下分別為對照組的69.94%、58.81%、90.06%；Zn2+處理分別為對照組的67.55%、61.26%、78.92%；復合脅迫的葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b分別為對照組的42.43%、30.99%、63.11%。Cu2+、Zn2+復合脅迫的變化幅度比單一脅迫更大，對苦草葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b的抑制性表現為：復合脅迫>Zn2+脅迫>Cu2+脅迫。

T1到T5階段，隨著Cu2+、Zn2+和復合脅迫濃度的增大，葉綠素a/b呈持續下降趨勢，其最小值分別為對照組的65.30%、77.15%、48.24%，說明復合脅迫的降低程度大于單一脅迫，對葉綠素a/b的抑制性表現為：復合脅迫>Cu2+脅迫>Zn2+脅迫。

表1 不同濃度Cu2+、Zn2+處理對苦草光合色素指標的響應

3 討論

目前，關于植物抗氧化酶活性的研究很多。SOD、POD、MDA是植物防御系統的重要組成部分，對維護植物保護酶系統發揮重要的作用[15]。當植物受到外界條件干擾時，酶活性平衡被破壞，會產生過多的O2-、H2O2、OH，然后進一步加快膜脂過氧化進程，降低植物體的膜系統完整性[16]。研究表明：外界環境的脅迫會造成植物體電解質和小分子有機物外滲，導致細胞內外物質交換的平衡受到影響，進而影響正常的細胞生理代謝功能[17]。SOD在提高植物抵抗逆境方面有重要的作用。一般情況下，重金屬的毒害導致植物體內產生過多的O2-，為消除這種影響，植物本身通過提高SOD酶活性來催化轉化O2-為H2O2，保護細胞免受損傷[18]，因此植物SOD活性隨重金屬的升高而逐漸增大，本研究中，苦草脅迫培養14d中，T1至T4處理階段的SOD活性確實符合這一特征，而T5處理組中的Cu2+單一脅迫和復合脅迫卻呈下降趨勢，這可能是由于重金屬的脅迫已經超出了苦草的耐受力，抑制了植物本身的酶活性，所以出現了SOD先升后降的現象。Cu2+、Zn2+都是植物生長所需的元素，能夠參與其正常的生理活動，有利于細胞內外的細胞物質交換[19]，這也是三種處理的T1處理組SOD值均略低于對照組的原因。另外，可能是由于Zn2+的存在降低了Cu2+對苦草的傷害，緩和了部分重金屬的影響，導致三種處理方式對苦草的抑制性表現為：Cu2+脅迫>復合脅迫>Zn2+脅迫。

POD催化H2O2分解成H2O和O2[20]，其受重金屬脅迫變化規律與SOD非常類似，在實驗前期隨重金屬的升高而顯著增大，但在高濃度的影響下卻開始降低。本研究中，三種脅迫的T5處理組中均有觀察到POD顯著下降的現象，說明高濃度的重金屬脅迫破壞了正常的酶功能，導致酶系統清除活性氧的能力減弱，H2O2和O2-等大量積累，引發細胞正常生理功能混亂，與SOD降低的原因相似，這里和計汪棟[21]等人的研究結果符合得很好。MDA含量代表細胞膜被氧化的程度[22]，用來反映植物逆境或衰老過程膜脂的破壞程度，含量越高表明植物受抑制的程度越嚴重[23]。MDA含量過高或過低都可能對植物的光合作用造成影響[24]。本實驗中苦草的MDA含量隨重金屬濃度的升高呈顯著上升趨勢，說明苦草的生命活動受重金屬抑制情況明顯加重。徐勤松[25]等人的研究成果也證實重金屬能導致植物體內膜脂過氧化產物(MDA)明顯上升。T5處理組中Cu2+和Zn2+單一脅迫下的MDA值達到最大，但復合脅迫卻使得其活性降低，可能是由于此兩種重金屬之間的相互作用導致MDA酶活性受影響程度明顯增加，進而導致植物體本身的酶保護系統遭到破壞，因此T5處理組中的MDA含量明顯降低。三種抗氧化酶活性中，除SOD外，POD和MDA的復合處理所造成的影響較兩種重金屬單一脅迫更大，其次是Cu2+單一脅迫，Zn2+產生的影響最小，可能由于Cu是非?；钴S的氧化還原型過渡金屬元素，它能吸收或釋放一個電子(Cu2+/Cu+)，從而產生自由基導致損傷[26]，而Zn的化學性質比Cu要弱的多。

葉綠素a和葉綠素b對苦草光合作用的進行都具有重大幫助。葉綠素a+b能夠反映植物葉片光合活性的強弱，代表對光能的利用率[27]。本研究中，葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b的T1處理組各葉綠素含量略高于對照組，其原因可能是少量的Cu2+、Zn2+都能夠有助于合成葉綠素。T1到T5處理組中各葉綠素含量指標隨重金屬脅迫濃度的升高而顯著降低，在實驗中也可以看到苦草葉片表面明顯失綠的現象。有學者認為重金屬離子與葉綠體蛋白上的巰基結合[28]，破壞了葉綠體的基本結構；此外，重金屬還能夠與某些合成葉綠素的酶(原葉綠素酸酯還原酶和膽色素原脫氨酶)相結合，使得酶活性大幅下降，阻礙了葉綠素的合成[29]。本研究中，葉綠素a比葉綠素b下降更快，說明葉綠素a對重金屬更敏感。Cu2+、Zn2+對苦草葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b的抑制性表現為：復合脅迫>Zn2+脅迫>Cu2+脅迫。Ca/Cb始終呈下降趨勢，說明兩種重金屬都能加速苦草葉片的衰老，且復合脅迫的降低幅度最大，Zn2+單一脅迫變化程度最小。就對苦草抑制性而言，復合脅迫>Cu2+單一脅迫>Zn2+單一脅迫。

4 結論

Cu2+、Zn2+單一及復合脅迫對苦草的抗氧化酶活性和葉綠素含量均能產生抑制作用。

除SOD活性外，三種脅迫對苦草POD、MDA和各葉綠素含量的抑制效果表現為協同作用。