栽培方式對紅壤性稻田土壤微生物群落結構和多樣性的影響

林小兵，時紅，武琳，成艷紅，才碩，黃尚書，何紹浪，黃欠如，張昆*

1. 江西省紅壤研究所/國家紅壤改良工程技術研究中心，江西 進賢 331717；2. 江西省灌溉試驗中心站，江西 南昌 330201；3. 東華理工大學，江西 南昌 330013

土壤微生物是土壤中最活躍的部分，在維持土壤功能和生態系統穩定及可持續性利用上發揮著重要作用（Cardinale et al.，2006；Heijden et al.，2013）。稻田土壤中微生物的代謝活動可調節土壤營養物質的循環（蔡元鋒等，2014），參與有機質分解和腐殖質合成，維持稻田土壤肥力，促進水稻的養分吸收，對保持土壤健康和農業可持續生產具有重要作用（Nannipieri et al.，2003；Kulmatiski et al.，2008；潘孝晨等，2019）。基于16S rRNA基因的分子生物技術可以較全面和準確地反映土壤微生物群落結構，從整體上分析物種遺傳多樣性，在微生物群落多樣性的表征方面優勢明顯（Edgar，2013；夏圍圍等，2014），目前已被廣泛應用于土壤微生物多樣性的研究。合理的栽培方式不僅可以提高作物產量和資源利用率，而且可促進農田生態系統的良性發展（吳晶等，2018）。我國水稻栽培方式主要包括人工栽插、機械插秧、機械直播、人工拋秧、缽苗行栽等（唐海明等，2014），其中水稻機械化生產呈現快速發展趨勢，機械化種植水平已達到7.1%（何瑞銀等，2008；張軍等，2013）。土壤微生物對栽培方式較為敏感，栽培方式的改變對土壤形成不同程度的擾動，在影響土壤微域環境的同時，會引起土壤微生物群落結構和功能多樣性的變化（Gil et al.，2011；鐘文輝等，2004；王蕓等，2007）。但是，Piovanelli et al.（2006）的研究表明，常規耕作對耕作層土壤微生物生物量碳含量的影響較小，Bowles et al.（2014）的研究也發現農業管理措施的改變對土壤養分及酶活性的影響較大，而對土壤微生物類群的影響較小。

在南方紅壤性稻田，與傳統栽培方式-移栽相比，拋秧、直播和機插這3種栽培方式是否改變土壤微生物群落結構。但是，目前關于栽培方式對稻田土壤影響的研究較多，且主要集中在土壤理化性質，如土壤養分、團聚體、有機碳等方面（陳冬林等，2010；龐緒等，2013；武均等，2018）；在栽培方式上，大多是常規耕作、免耕或輪作、連作之間的比較等（李文嬌等，2015；張立成等，2017；鄧超超等，2019），而有關不同栽培方式對稻田土壤微生物群落結構和多樣性影響的研究較少。近年來，隨著農村勞動力轉移，輕型、高效的水稻簡化栽培已成為水稻生產發展的迫切需求。與傳統栽培方式-移栽相比，拋秧、直播和機插等3種輕簡栽培方式是否影響土壤微生物尚不明確。本研究基于野外田間小區實驗，應用16S rRNA基因的高通量測序技術研究移栽、拋秧、直播和機插4種栽培方式下稻田土壤微生物群落結構組成和和物種多樣性，以期為水稻優化栽培種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗于 2017年在江西省灌溉試驗中心站試驗場進行。試驗點位于江西省南昌市南昌縣向塘鎮高田村（28°26'N，116°00'E），屬亞熱帶季風氣候，年均溫為17.7 ℃，年降雨量為1685 mm。試驗田土壤為第四季發育的紅壤性水稻土，土質粘重，呈酸性，基礎土壤（0—20 cm）的pH值為5.24，有機質質量分數為 22.92 g·kg?1，全氮為 1.46 g·kg?1，全磷為 0.36 g·kg?1，全鉀為 19.38 g·kg?1，有效氮為140 mg·kg?1，有效磷為 25.40 mg·kg?1，速效鉀為 215 mg·kg?1。試驗區早稻產量 6500 kg·hm?2，晚稻產量7250 kg·hm?2。

1.2 試驗設計

本試驗設置移栽、拋秧、直播和機插4種栽培方式，均重復3次，共計12個小區，每個小區面積120 m2（7.5 m×16.0 m）。供試早稻品種為中嘉早17，屬秈型常規水稻，于2017年3月27日前后播種，7月13日前后收割；供試晚稻品種為H優518，屬三系雜交中熟晚秈，于2017年6月25日前后播種，10月28日前后收割。育秧機制為：移栽-水育秧、直播-水直播、拋秧-塑盤濕潤育秧和機插-濕潤育秧。復合肥中N、P、K含量為15%、15%、15%。各試驗處理小區的具體施肥量見表1。

1.3 土樣采集

2017年分別在水稻早季和晚季的分蘗期、灌漿期和成熟期采集根際土壤，每個小區采用5點法在水稻根部周圍用土鉆采耕層土（直徑5 cm，深20 cm），裝入密封袋，立即置于冰盒中運回實驗室，剔除水稻根系殘體和雜物后經冷凍干燥，于?70 ℃冰箱中保存，用于土壤微生物分析，同時從早稻時期的樣品劃分出一份子樣品于土壤理化性質的測定。水稻產量采取實打實收的方式測量。

1.4 高通量測序和理化性質測定

本研究采用細菌16S rRNA基因的V3—V4區域作為目標DNA序列進行PCR擴增。以前端引物343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）和后端引物798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′）對 16S rDNA的V3～V4進行擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，25個循環；72 ℃延伸20 min。擴增結束后，對PCR擴增產物使用2%瓊脂糖對PCR擴增產物進行凝膠電泳，檢查擴增效果。將樣品的PCR產物在Illumina Miseq平臺上進行高通量測序。土壤微生物總DNA提取和測序服務委托上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

土壤pH值測定采用電位法；有機質測定采用高溫外熱重鉻酸鉀法；有效氮測定采用水培養法；有效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法；速效鉀測定采用1 mol·L?1乙酸銨浸提-火焰光度法；全氮測定采用自動定氮儀法；全磷測定采用分光光度計比色法全鉀測定采用火焰光度法。

表1 試驗各處理具體施肥量Table 1 Definite fertilization amount of each treatment kg·hm?2

1.5 數據分析

首先對有效序列進行去雜和修剪得到優化數據，使用軟件Trimmomatic和UCHIME對連接上的序列進行過濾和去除嵌合體（Edgar et al.，2011；Bolge et al.，2014），然后對所有優質序列使用VSEARCH軟件以 97%相似度進行 OTU劃分（Rognes et al.，2016），隨后從各OTU中挑選豐度最大的序列作為代表序列，與Silva數據庫（SILVA SSU and LSU databases 128）進行比對后最終得到系統發育樹和OTU分類表格（Quast et al.，2013）。采用QIIME（Caporaso et al.，2010）軟件計算微生物群落α-多樣性指數（Shannon指數和Simpson指數），OTUs的多度和豐富度。應用 R語言（www.r-project.org）統計軟件進行方差分析、相關性分析和主成分分析，并通過Tukey HSD檢驗法對各處理進行差異顯著性檢驗。所有制圖通過R語言軟件的ggplot 2程序包完成。

2 結果與分析

2.1 微生物群落結構組成

不同栽培方式在分類水平上的物種組成比例可以反映群落結構的變化。在早稻和晚稻時期，不同栽培方式土壤微生物群落組成類似，但不同處理中各種土壤微生物所占的比例有所差異。門水平上（圖 1），在早稻和晚稻時期，都以變形菌門（Proteobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢類群，占比分別為30.26%—40.31%、18.23%—23.66%、11.50%—16.28%和9.75%—13.68%。

2.2 微生物OTUs韋恩圖

根據樣品OTUs的交疊情況繪制韋恩圖，用于分析不同樣品之間共有和特有的OTUs。OTUs的重疊情況見圖2，圖中數字表示所在區域的OTU數目。從圖 3a可以看出，在早稻時期，直播樣品中含有OTUs 2975個，其中特有的OTUs 22個；移栽樣品中2837個，其中特的OTUs 9個；拋秧樣品中2737個，其中特有的OTUs 7個；機插樣品中2993個，其中特有的OTUs 56個。從圖3b可以看出，在晚稻時期，直播樣品中含有OTUs 3069個，其中的OTUs 18個；移栽樣品中2929個，其中特有的OTUs 13個；拋秧樣品中2881個，其中特有的OTUs 10個；機插樣品中3065個，其中特有的OTUs 48個。

2.3 微生物群落多樣性分析

如圖3所示，在早稻和晚稻時期，不同栽培方式間的Shannon指數和Simpson指數差異沒有顯著影響（P＞0.05）。不同栽培方式間OTUs的豐富度差異顯著（P＜0.05，圖3c），豐富度大小順序為直播＞機插＞拋秧＞移栽，具體表現為直播和機插的豐富度顯著高于移栽，拋秧與移栽間的豐富度沒有明顯差異。不同栽培方式間 OTUs的多度差異顯著（P＜0.05，圖 3d），多度大小順序為直播＞機插＞移栽＞拋秧，具體表現為直播的多度顯著高于拋秧，拋秧與移栽間的多度沒有明顯差異，同時在早稻時期，機插的多度顯著高于拋秧。

圖1 不同栽培方式土壤微生物在門水平上的物種組成變化Fig. 1 Changes in species annotation to OTUs of soil microorganism from different cultivation methods at a phylum

圖2 不同栽培方式土壤微生物OTUs的韋恩圖Fig. 2 Veen diagram of soil microorganism based on OTUs under different cultivation methods

圖3 不同栽培方式土壤微生物群落的Shannon指數（a）、Simpson指數（b）、豐富度（c）和多度（d）Fig. 3 Comparison of Shannon index (a)，Simpson index (b)，richness (c) and abundance (d) of soil microorganism under different cultivation methods

2.4 微生物群落的主成分分析

基于群落結構（即物種豐度及分布）的β多樣性可用來比較不同分組樣本的差異。圖4中每個點表示一個樣品，樣方距離大小表示樣方間微生物群落結構的相似程度，距離越近相似程度越高。在早稻和晚稻時期，土壤微生物群落在不同栽培方式間存在顯著差異（早稻：R=0.53，P=0.001；晚稻：R=0.65，P=0.001），特別是直播、機插微生物群落顯著不同于移栽和拋秧，同時直播微生物群落也顯著不同于機插，土壤微生物群落組成差異較大，微生物群落結構相似程度低；而移栽和拋秧微生物群落有部分重合，說明它們之間微生物群落結構較為相似，微生物組成差異較小。

2.5 栽培方式對水稻產量和土壤理化性質的影響

在早稻時期，與傳統栽培方式-移栽相比，機插、拋秧和直播水稻產量均減少，分別為：17.49、17.36和8.37%，且移栽水稻產量顯著高于其他3種栽培方式（P＜0.05，圖5a）。在晚稻時期，機插、拋秧和直播水稻產量較傳統栽培方式-移栽分別降低了7.92%、0.48%和 13.98%，且移栽水稻產量顯著高于機插和直播（P＜0.05，圖5b）。在早稻時期，移栽、機插、拋秧和直播這4種栽培方式對土壤pH、有機質、有效氮、有效磷、速效鉀、全氮、全磷和全鉀均無顯著影響（P＞0.05，圖6）。

圖4 不同栽培方式土壤微生物群落的主成分分析（PCA）Fig. 4 Principal component analysis (PCA) in soil microorganism under different cultivation methods

圖5 栽培方式對水稻產量的影響Fig. 5 Effect of cultivation methods on rice yield

3 討論

3.1 栽培方式對土壤微生物群落結構的影響

微生物群落結構及組成與所處的環境密切相關，栽培方式的改變會引起稻田土壤理化性質、水氣熱條件等變化，進而影響土壤微生物群落結構。本研究中，不同栽培方式下紅壤性水稻土在門水平上以變形菌門、硝化螺旋菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為優勢類群。沈冰潔等（2015）研究表明農田土壤優勢細菌類群為變形菌；Jangid et al.（2008）分析了不同類型耕作土壤的細菌種群結構，也發現變形菌門細菌占主要地位；張文鋒等（2018）的研究結果也表明，不同栽培方式下早稻和晚稻的土壤中變形菌門占主要優勢，所占的比例均在30%—40%，其次為綠彎菌門、酸桿菌門，本研究結果與之相似。

圖6 栽培方式對土壤理化性質的影響Fig. 6 Effects of cultivation methods on soil physical and chemical properties

從韋恩圖（圖 3）可以看出，晚稻時期共有和特有的OTUs高于早稻，都表現為機插處理最多，其次是直播，最后是移栽和拋秧。晚稻秸稈生物量多于早稻時期，且氣溫高，有機質分解快，土壤養分較豐富，有利于提高微生物多樣性（譚周進等，2006）。機插處理采用了商品育秧基質進行育秧，栽插時帶入大田的微生物群落及活性要優于其他栽培方式，更能夠激活土壤微生物。王毅琪等（2017）研究發現將深耕和秸稈還田方式相結合，可以使土壤層頻繁擾動，通氣性增加，微生物與秸稈等有機質接觸面積增大，營養源的豐富促進了微生物生長，提高了土壤酶活性。趙亞麗等（2015）研究發現，與常規耕作相比，深耕可以提高土壤微生物數量和酶活性分別提高。直播處理相對于其他栽培方式，本田期更長，且增加了斷奶肥，而施肥可以通過提升土壤養分從而增加土壤微生物數量（李秀英等，2005；夏昕等，2015）。

3.2 栽培方式對土壤微生物多樣性的影響

多樣性指數是評價微生物群落多樣性的重要指標，多樣性指數越高表明微生物群落的豐富度和多樣性越高。本研究表明，在不同栽培方式下，Simpson指數和Shannon指數有所不同，但沒有顯著性差異，但4種栽培方式間OTUs的豐富度和多度差異顯著，其中豐富度表現為直播＞機插＞拋秧＞移栽，且直播和機插豐富度顯著高于移栽；多度表現為直播＞機插＞移栽＞拋秧，且直播多度顯著高于拋秧。已有研究表明農業管理措施的改變對土壤養分及酶活性的影響較大，而對土壤微生物類群的影響較小（Bowles et al.，2014）。土壤養分可以提高土壤微生物活性及豐富度（唐海明等，2016），本試驗條件下，栽培方式對土壤養分影響較小，栽培方式減少了對土壤微生物的影響。與移栽和拋秧相比，直播和機插的栽培方式物種數和數量增加。在早稻和晚稻時期，土壤微生物群落結構在不同栽培方式間存在顯著差異，表現為直播、機插微生物群落顯著不同于移栽和拋秧，同時直播土壤微生物群落也顯著不同于機插，而移栽和拋秧微生物群落有部分重合。移栽和拋秧都是經育秧后栽培，稻田土壤溫濕度和理化性質相似，土壤微生物群落差異小。而直播是省去育秧和插秧的兩個步驟，直接將稻種通過一定的規范化流程播撒到田里；機插是將水稻秧苗定植在水田中的種植機械過程，其對稻田的土壤性狀的影響不同于移栽和拋秧。晚稻種植過程中由于氣溫較高以及水稻秸稈和殘茬會增強土壤中微生物活性，增加有益微生物，造成早晚稻土壤微生物多樣性的差異。除了栽培方式，土壤微生物的多樣性和豐度還受施肥水平、土壤養分、水熱狀況及通氣性的直接影響（Asadu et al.，2015；任鳳玲等，2018；張彥軍等，2019）。

3.3 栽培方式對水稻產量和土壤理化性質的影響

本試驗發現，與傳統栽培方式-移栽相比，機插、拋秧和直播水稻產量均降低；在早稻時期，4種栽培方式間土壤養分差異不顯著。張軍等（2013）研究表明，不同類型品種晚粳稻產量均表現為手栽＞拋秧＞機插的趨勢，不同栽培方式間產量差異達到顯著或極顯著水平，與本試驗結果相似。曾勇軍等（2012）研究認為雙季超級晚稻產量以人工移栽和翻耕拋秧較高，機插秧次之，免耕拋秧、機直播、撒直播較低，原因可能是產量受單位面積有效穗數影響。移栽產量最高的原因是其總穎花量、結實率和千粒重均較高，而拋秧和機插的各生育期均相應推遲，且兩者全生育期亦縮短（張軍等，2013）。同時機插和直播由于根系分布淺，生產中存在著灌漿結實期遭遇臺風暴雨等不利氣象狀況，植株倒伏風險大，穩產性差的問題；特別是直播稻，還存在秧苗全苗勻苗技術難度大、雜草雜稻危害嚴重等（李杰等，2011）。微生物是水稻與土壤之間的養分循環的重要媒介，而栽培方式之間土壤養分沒有差異，可能是4種栽培方式肥料使用量相等，對土壤養分影響少。

綜上所述，與傳統栽培方式-移栽相比，直播、機插和拋秧沒有顯著性改變土壤微生物多樣性，只是在一定程度上增加土壤微生物OUTs豐富度和多度。隨著土地流轉及農村勞動力轉移對輕簡化栽培技術的需要，在雙季稻主產區可大規模采取水稻直播、機插和拋秧3種栽培方式。但是水稻機插、直播需綜合考慮選擇適宜的水稻品種和播種期，以保證秧苗素質，以提高移栽質量，特別需要注意水稻產量；同時加強農機農藝的融合發展，比如免耕或秸稈還田等措施。有關栽培方式對土壤微生物的影響，需要注意土壤溫濕度以及可利用殘留物和作物生長的季節變化等因素，同時還需要結合土壤理化性質、水稻產量等因素，特別是栽培方式對根際和土壤物理結構的影響，才能客觀正確地評價4種栽培方式。

4 結論

移栽、直播、機插和拋秧這4種栽培方式的土壤微生物群落組成相似，均以變形菌門、硝化螺旋菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為優勢類群；機插特有的 OTU數量明顯高于其他栽培方式。栽培方式間多樣性指數沒有顯著性差異，但土壤微生物 OTUs的豐富度和豐度表現為直播和機插最高。主成分分析表明直播、機插土壤微生物群落結構顯著不同于移栽和拋秧，而移栽和拋秧土壤微生物群落結構有部分類似。與移栽相比，機插、拋秧和直播水稻產量均減少；在早稻時期，4種栽培方式間土壤養分均無顯著差異。