基于代謝組學的錳毒性作用機制分析

陳 健 朱 馴

(鹽城工業職業技術學院，江蘇 鹽城 224005)

隨著現代工業化的迅速發展，過多排放廢棄物以及重金屬，環境變得越來越糟糕。金屬(重金屬)因其有毒性和對環境具有強烈的生物富集作用而成為最嚴重的環境污染物類型之一。金屬離子可以通過不同的途徑緩慢積累在植物和動物體內，以不同的方式移動和循環，從而影響動物的食品安全。且其一旦進入人體，就會傷害人體的健康。人體的健康和公共衛生與食品安全有著密切的聯系。食品安全也一直是政府工作的重心。

以各種化學狀態或化學形態存在的重金屬在進入環境或生態系統后會存留、積累和遷移，造成危害。錳是哺乳動物和許多小型生物的必需營養元素，但它進入環境后會使環境的正常組成和性質發生變化，直接或間接有害于人類生存或造成自然生態環境衰退。長期接觸錳會直接損害人體內的神經中樞或導致免疫系統等產生有害因素，并通過周圍循環進入大腦，最終會導致神經出現功能障礙。

錳產生毒性作用有很多原因，其容易感染的人群廣泛。因此錳的毒性作用和慢性低水平錳的暴露問題成為公共衛生普遍關注的問題。在此次的探討中，我們在合理建立錳中毒模型后，將高通量蛋白質組學和代謝組學分析用于全面分析錳中毒期間人體蛋白質和小于500的分子的代謝變化。同時也對于代謝通路的改變情況實施了探討，以期能夠對錳中毒進行早期判斷和診治，還為動態性檢測的實施等工作提供更為可靠的理論依據。

1 基于代謝組學的錳毒性作用機制分析

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗儀器和試劑

高溫高速離心機，超高效液相色譜儀5600+質譜儀，真空冷凍干燥機，甲酸色譜柱，乙腈，氟化銨，甲醇。

1.1.2 實驗方法

實驗選取兩月大、體積為220 g的30只雄性老鼠，并均無特定病原體。把這些老鼠隨機劃分成兩個組：試驗組和對照組。其中，在試驗組使用2個重復性的方式，一個重復中用掉10只老鼠。整個測試周期為5周，建立大鼠錳中毒模型。試驗結束時，使用抗凝劑從股動脈中收集血液，在4 ℃下以2 000 G離心10分鐘，并將血漿迅速儲存在液氮中，最后一起轉入-80 ℃的冰箱保存，并用于代謝組學的分析。從不同的樣本中各取30 μL并將其混合成質控樣本。質控樣本用來均衡液相色譜質譜聯用系統及放置樣品前檢查儀器狀態，以及評估系統穩定性。

1.1.3 樣本預處理

從每個樣本中各取100 μL，再添加提前預冷的甲醇或者乙腈，并且來回搖晃均勻，在-20 ℃條件下放置10 min；然后采用4 ℃ 2 000 G的條件下進行10 min 的離心處理，再抽取380 μL的上清液，通過原位真空凍干獲得凍干粉末，并儲存用于隨后的分析。如上所述準備質量控制樣品，用來評估系統在整個試驗過程中的穩定性。抽取乙腈水溶液100 μL加入制備的凍干粉樣本中，來回搖晃，進行復溶，離心后(4 ℃，14 000 G，15 min)，收集上清液用于測量離子質荷比的分析。

1.1.4 色譜-質譜(LC-MS)分析

隨著年齡增長，自然老化或光老化都會造成皮膚生物黃色素的堆積，其中年齡與脂褐素含量的關系早有報道[20]。隨著年齡增長，脂褐素會在人體細胞內逐漸沉積，不僅影響皮膚顏色，而且能夠通過擠占細胞空間位置，影響細胞正常功能。隨著年齡增長，對脂褐素的清除能力降低，進一步造成脂褐素沉積。

1.1.4.1 色譜條件

色譜條件是：進樣量2 μL、流速300 μL/min、柱溫25 ℃，借助于反相UHPLC對樣本實施進一步的分離處理。正離子模式的流動相組成(HSS T3色譜柱)為A液：0.1%formic acid+99.9%water，B液：0.1% formic acid+99.9% ACN；負離子模式流動相組成A液：0.5mM ammonium fluoride+water，B液：CAN。

為了防止儀器出現問題，順機持續分析放在4 ℃的自動進樣器中的樣本，為了提高數據測試中的可靠性，在分析樣品的過程中，每5個樣品中放一次質量控制樣品，它的主要的作用是用來評價和檢驗系統的穩定

1.1.4.2 質譜條件

使用分離儀器處理樣品后，在質譜儀上使用電噴霧，正電和負離子模式條件進行質譜分析。在通過全掃描獲取主要質譜圖的同時，使用依賴于數據的采集模式和高靈敏度模式獲取次要質譜圖。

為了防止儀器出現問題，順機持續分析放在4 ℃的自動進樣器中的樣本，為了提高數據測試中的可靠性，在分析樣品的過程中在每5個樣品中放一次質量控制樣品，它的主要的作用是用來評價和檢驗系統的穩定性。

1.1.5 數據處理

使用XCMS程序可以有效地提取原始數據的相應峰面積，并將其轉換格式，同時保留時間校正和峰對齊；此外，如何以準確的質量匹配二次光譜取決于代謝物。排除并歸一化該組中丟失的離子峰，然后使用多統計分析(例如，監督主成分分析)，并使用各種一維統計分析方法。例如，借助軟件編程語言，可以進行火山圖分析和變分多元分析。最后，查到與錳的有毒性有關的對機體穩態平衡產生干擾的代謝產物。

1.1.6 代謝物鑒定和通路分析

根據檢測所有帶電離子的質荷比和強度，以及分析所形成的子離子的質荷比和強度。使用METLIN數據庫來識別不容易發現的細胞生長增殖有關的標志物。通過搜索METLIN，KEGG，HMDB，LIPIDMAPS，MassBank和Chemspider來搜索難以找到的生物體征。使用更準確的分子量或MS片段模式數據和文獻來搜索確定影響的代謝途徑，從而進行準確的生物學解釋。

2 結果與分析

2.1 各組血漿樣本的典型代謝譜圖

代謝組學數據在對分析方式的穩定中起著非常重要的作用。在該實驗中，使用了混合均勻的質控樣品。質控樣品作為真實樣品處理，質控樣品在正的負的離子批處理過程中每5個樣品插入一次，用來評價和檢驗系統的穩定。質控樣品應包括相似的色譜峰形狀，分離度，保留時間和響應強度分布。比較了檢測過程中質控樣品的UHPLC-Q-TOF MS總離子流色譜圖。圖1顯示色譜峰的保留時間和響應強度是一致的，并且峰基本重疊在一起的。它很穩定，幾乎沒有因設備引起的錯誤。

圖1 QC樣品正(a)、負(b)離子模式TIC重疊圖譜

使用XCMS軟件提取代謝物離子峰，一共有17 917 個離子峰，其中陽離子的模式提取到了12 793個離子，陰離子的模式提取了5 120個。這主要用于進一步處理從每個樣品中提取的峰，分析后可以得出結論，樣品a屬于緊密簇(見圖2)。這反映出儀器分析系統的高度穩定性以及有效解釋樣品之間生物學差異的能力。

本研究應用非靶向代謝組學研究慢性錳暴露對血漿代謝的影響。與常規高效液相色譜質譜聯用相比，它擁有更高的靈敏度、峰值和分離度，因此適合代謝組學研究。分析給出了每個樣品的典型圖，相關情況如圖3所示。根據實驗條件，對照樣品和實驗樣品的光譜基本相似，峰形良好，峰彼此分離。這表明在這項研究中使用的色譜和質譜條件適合確定樣品。

圖2 正離子(a)、負離子(b)模式下樣本的PCA得分圖

圖3 對照組和錳處理組中血漿樣品的正離子(a)、負離子(b)模式 TIC 譜

2.2 歸一化處理

歸一化過程可確保代謝組學數據的精確和完整，并降低系統上或技術上的錯誤概率。同樣，代謝物的濃度通常在數量級上，這可能導致對代謝物的錯誤識別，并發生很大的變化，我們除去代謝產物超過了50%的缺失值；對數轉換后通過Pareto標準化代謝物表達水平，應用縮放方法篩選具有生物學和統計學意義的重要代謝物。歸一化后，每組樣品的正離子和負離子模式數據均顯示正態分布(圖4)。

(a)

2.2.1 主成分剖析(PCA)

為了確定兩組血漿的代謝產物譜中是否存在任何特定差異，采用無監督方法在兩種離子模式下評估了實驗組和對照組的分辨率。處理所有代謝物后，我們觀察了所有樣品總體上的分布趨勢，從組內外之間的區別，并線性組合以查找可能的離散點。在PC1和PC2尺寸上，正離子模式的變異性的指數為31.9%(圖5a)，負離子模式的變異性的總體指數為26%(圖5b)。在2D評分圖中，兩組之間的分離趨勢略微但微不足道。這表明對照組與血漿譜有著很大的變化，無明顯變化。

(a)

2.2.2 偏最小二乘判別分析

為了用于區分對照組和錳處理組的離子峰，本研究構建了用于監督的偏最小二乘判別分析模型。與模型實現相比，模型更加關注實際的分類差異。這是一種用于監控判別分析的統計技術。主成分分析的思想主要是將高維數據降為低維數據，俗稱“降維”。以最大化不同組之間的分離，然后進行監督分析，以最大化代謝物的分離和鑒別，可以預測樣品的相應類別。通常，可變的投影重要性被用作幫助篩選標記代謝物的標準。從得分表可以得出結論，錳處理組和對照組在正離子和負離子兩種成分模式下存在明顯差異。這可以反映出該模型是非常可靠和可預測的。兩個得分圖顯示，正離子和負離子模式傾向于將對照組和錳處理組分開，并且錳暴露改變了有些代謝產物的水準(圖6)。

(a)

2.2.3 單變量統計分析

單變量分析經常使用的方式是T檢驗和分析圖；該方法通常篩選FC>2.0和P<0.05的潛在標記代謝物。圖7顯示了對照組和錳處理組的正離子和負離子形式的相關數據的火山圖。灰點代表通過單變量統計分析選擇的差異性代謝產物。

(a)

3 結論

由UHPLC-Q-TOF/MS為基礎的非靶向代謝組學技術為探究錳誘導的代謝變化給出了不一樣的視角。確定了三十幾種與錳暴露相關聯的血漿代謝產物，其中十幾個表現出明顯上調的變化，而其他的二十幾種表現出明顯的下調。這些代謝產物通常涉及嘌呤，不同RCHNH2COOH和脂肪酸的代謝。錳如果暴露就會損害RCHNH2COOH、脂肪酸的代謝。

綜合上面所描述的，錳的神經毒性機理為：錳是一種微量金屬，在維持正常的細胞功能和新陳代謝中起著重要的作用。但是，錳的過度積累會引起腦功能的退化，由此引起的神經系統疾病稱為錳中毒。錳的毒性對氧化應激，線粒體損傷，多巴胺能神經元損傷和內質網應激等方面都是有害的；錳進入人體后會激活周圍的免疫系統，導致周圍組織產生促炎因子信號。具有炎性的細胞因子通過轉運和其他方法穿過血腦屏障，然后再進入神經系統，并引起神經出現炎癥；錳暴露可直接在循環系統中產生ROS，破壞血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，產生更多的Aβ；錳進入腦中會引起大腦功能紊亂。除此之外，錳還可以在肝臟中富集，這可能會導致肝臟受損。