泛素特異性蛋白酶在心血管疾病中的研究進展

王妍莉 滕宗艷

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是導致死亡的重要原因，給人們的身心健康造成巨大負擔。目前，CVD的發病率在世界范圍內仍不斷上升，積極尋找防治CVD的途徑迫在眉睫[1]。近年來，人們發現泛素特異性蛋白酶(ubiquitin specific proteases，USPs)在動脈粥樣硬化(atherosis，AS)、心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭(心衰)等CVD中發揮重要作用，通過各種通路調控著CVD的發生發展過程。本文就USPs在CVD中的作用進行綜述，旨在為CVD的防治提供一個新的途徑。

1 USPs概述

1.1 泛素化途徑及去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)分類 泛素是一類真核細胞內廣泛存在的大小為76個氨基酸殘基的小分子蛋白質，可與多種形式的特異性靶蛋白偶聯，即多泛素化和單泛素化。泛素化修飾的過程是在ATP供能的情況下，泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)激活泛素，轉移到泛素結合酶(ubiquitin-conjuagtion enzyme, E2)上，再和泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzyme，E3)共同識別靶蛋白，對其進行泛素化修飾，從而影響靶蛋白的活性、定位、蛋白之間的相互作用及穩定性，參與調控蛋白酶體對蛋白質的選擇性降解、細胞信號轉導、轉錄、轉運、自噬和免疫反應等過程[2-4]。DUBs是逆轉泛素化的一類酶。大約有100個人類基因組編碼的DUBs被發現，他們目前可分為6個家族：USPs、泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin carboxyterminal hydrolases, UCHs)、卵巢腫瘤相關蛋白酶家族(ovarian-tumor proteases, OTUs)、Machado-Joseph疾病蛋白酶家族(Machado-Joseph disease protein domain proteases, MJDs)、單核細胞趨化誘導蛋白家族(monocyte chemotactic proteininduced protein, MCPIPs)和JAMM/MPN金屬鈦酶家族(JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases, JAMMs)，其中只有JAMMs是鋅金屬鈦酶，其余5個家族皆是半胱氨酸鈦酶[5]。

1.2 USPs的結構和功能 USPs是DUBs中占比最多的成員，有近60個子成員。每個子成員都具有像手指、拇指和手掌一樣的3個區域組成的高度保守的USPs結構域，USPs的催化中心位于手掌和拇指的交界區域。也有一些USP具有其他結構域，如頭帕腫瘤綜合征蛋白(CYLD)的B-box結構域，USP3、USP5、USP39、USP44、USP45、USP49、USP51的鋅指結構域，USP4、USP7、USP14、USP32、USP47和USP48的泛素樣結構域，USP52的核酸外切酶Ⅲ結構域等。USPs結構域的數量和多樣性與其功能的多樣性密切相關，使其成為許多研究的重點。已經有大量研究表明，USPs參與調控細胞的生長、增殖、凋亡等多種生物學過程，在腫瘤、神經退行性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、CVD等多種疾病的發生發展過程中扮演重要角色[6]。USPs不僅維持著心臟正常生理活動，而且調控著CVD的病理過程。

2 USPs與CVD

2.1 USPs與心臟電生理 電壓門控鈣通道(voltage gated calcium channel，Cav)可以調節心肌興奮性和收縮性。心臟中鈣通道的定位和表達，可以調節竇房結心率，也可以調節房室結傳導，還可以調節工作心肌的心臟復極。鈣通道功能紊亂會導致心肌細胞異常興奮和心律失常[7]。已有研究證明，USP2-45可使上皮細胞鈉通道去泛素化并調節其在質膜上的表達[8]。USP8調控上皮細胞鈉通道的內體轉運[9]。也有研究證明，USP2-45和USP2-69均可對抗神經前體細胞表達發育抑制蛋白4-2(Nedd4-2)依賴的泛素化，從而恢復KCNQ1鉀通道的質膜定位[10]。既然USP可調節鈉通道和鉀通道，那么他在鈣通道中是否也有調節作用？Pouly等[11]發現USP2-45在細胞膜翻譯后水平具有時鐘輸出效應，并可能調節Ca2+的膜通透性。Rougier等[12]發現USP2-45和USP2-69均可使心臟Cav通道去泛素化。USP2-45作為研究的重點被發現可降低質膜上的Cav通道的數量?？梢奤SPs對維持離子通道的穩定具有重要作用，可能成為治療CVD的一個靶點。

2.2 USPs與AS

2.2.1 USPs對AS病因的影響：CVD的危險因素如高血壓、糖尿病、血脂異常、肥胖、吸煙等是AS的病因，積極預防以上這些病因，可以減少AS的發生。越來越多的研究表明，USPs與這些病因密切相關。

LDL水平的升高是AS的主要病因。LDL受體(LDLR)的突變使肝臟對LDL的清除減少，血漿膽固醇水平升高，從而加速AS，因此LDLR水平的穩定調控就顯得格外重要了。Nelson等[13]發現USP2與偶聯酶相互作用并促進其去泛素化，然后和LDLR組成復合體控制LDLR的降解。USP2調控脂蛋白代謝，為血脂異常和AS疾病的治療提供了可能。

肥胖的一個標志是脂肪生成功能障礙。Yang等[14]研究發現，十字花科蔬菜(如卷心菜)中富含的一種衍生物吲哚-3-甲醇在胃酸作用下代謝成更為穩定的3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-diindolylmethane，DIM)，DIM通過抑制USP2活性在脂肪生成早期抑制細胞周期進展，誘導細胞周期蛋白D1的翻譯后降解，從而起到抗肥胖作用。Huang等[15]研究了cullin-RING E3的調節因子COP9信號體的下調可以提高C/EBP同源蛋白抑制脂肪滴形成的作用，而USP15參與調控其過程。Akoumianakis等[16]研究發現，脂肪組織分泌體釋放的無翅相關整合位點5A通過USP17/RAC1介導的血管平滑肌細胞的NADPH氧化酶激活，調控肥胖對人類動脈氧化還原狀態的影響，以此說明USP17和無翅相關整合位點5A是預防和治療與人類肥胖有關的血管并發癥的有效靶點。

脂肪組織的慢性炎癥會加速脂肪細胞釋放脂肪細胞因子和脂質因子。Saito等[17]的研究表明，巨噬細胞USP2A(一種較長的USP2剪接變體)通過脂肪細胞依賴機制改善肥胖誘導的胰島素抵抗。也有研究表明，肝臟USP4過表達可明顯減輕非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)小鼠的肝脂肪變性、胰島素抵抗和炎癥反應[18]。Zhang等[19]的研究表明，運動可以增強肝USP4、USP18和雙特異性磷酸酶14對TGF-β活化激酶-1 (TGF-β-activated kinase 1, TAK1)磷酸化的抑制作用，來改善高脂飲食誘導的肥胖大鼠的胰島素抵抗。An等[20]的研究表明，USP18過表達也可以改善NAFLD小鼠的肝臟脂肪變性及脂質代謝紊亂。Ji等[21]發現CYLD通過與激酶TAK1相互作用并使其去泛素化，防止JNK-p38信號通路的活化來減輕肥胖小鼠的脂質積聚、胰島素抵抗、肝臟炎癥標志物的表達。而與USP2、USP4、CYLD可以改善胰島素抵抗不同的是，有研究表明USP14過表達可促進肝甘油三酯的積累，而USP14的下調可以改善肥胖小鼠的骨質疏松、高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗[22]。以上這些研究表明USPs可能通過調節脂質代謝、肥胖、血糖等因素影響AS的發生發展。

2.2.2 USPs在AS病理過程中的影響：AS的3個病理階段是：(1)動脈內膜的巨噬細胞和少數平滑肌細胞灶性積聚，細胞內外脂質沉積；(2)內膜增生的結締組織和含有脂質的平滑肌細胞、巨噬細胞組成的纖維病變；(3)纖維斑塊出血、壞死、潰瘍、鈣化、附壁血栓形成的復合病變。炎癥是構成AS的病理基礎，而巨噬細胞是主要的促炎因子。Kitamura等[23]的研究表明，USP2抑制脂多糖誘導的巨噬細胞樣細胞促炎細胞因子的表達。Jean-Charles等[24-25]在AS的小鼠模型中發現USP20可以抑制平滑肌細胞炎癥及頸動脈內膜增生，并進一步證明USP20通過抑制腫瘤壞死因子(TNF)觸發的平滑肌細胞炎癥來對抗AS。Takami等[26]在頸動脈球囊損傷的大鼠模型中發現CYLD過表達顯著抑制新生內膜形成，且表明CYLD可能通過抗炎和抗增殖作用減輕球囊損傷后的血管重構。研究還證實了在血管內皮細胞中，CYLD通過去泛素化TNF受體相關因子2抑制NF-κB活性來抑制炎癥和內皮細胞增殖，CYLD可能通過去泛素化Bcl-3抑制cyclin D1和E2F活性來抑制平滑肌細胞的增殖。Liu等[27]的研究表明，在血管平滑肌細胞中，CYLD通過激活TNF-α誘導的有絲分裂原活化蛋白激酶促進炎癥反應，而這個過程并不影響TNF-α誘導的NF-κB活性。血管外膜的成纖維細胞被外力刺激后分化為肌成纖維細胞，分泌多種物質，引起血管張力改變、血管炎癥發生和血管擴張等一系列反應，參與AS、血管重建的過程。Yu等[28]發現高同型半胱氨酸血癥小鼠通過上調Nox4促進血管外膜成纖維細胞的轉分化和促炎細胞因子產生以及加重腹主動脈瘤。進一步證實CYLD通過去泛素化Nox4誘導血管外膜成纖維細胞的轉分化。衰老可加劇AS的進展。Imaizumi等[29]報道了CYLD可能通過改變單核細胞對內皮細胞的黏附、巨噬細胞的脂質積聚和炎癥反應來調節年齡相關的AS的發生。USPs可能成為治療AS和血管炎性疾病的一個新靶點，也為該病的發病機制提供新的見解和方向。

2.3 USPs與心肌缺血再灌注損傷 心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死后一段時間的再灌注反而加重心肌損傷的病理過程。其發生機制可能與氧自由基的產生、鈣超載、炎性細胞浸潤、能量代謝紊亂等有關，嚴重時可導致惡性心律失常和猝死。因此，探索其防治措施很重要。Yu等[30]報道了β1腎上腺素能受體(β1-adrenergic receptors，β1AR)誘導的USP20活化可穩定β1AR在病理性心肌損傷中的表達。另外，Zhang等[31]的研究表明，在再灌注損傷后的AC16心肌細胞中，USP49水平呈時間依賴性增加，且USP49抑制了心肌細胞的凋亡和應激活化蛋白激酶1/2(JNK1/2)的激活。研究還表明，USP49通過雙特異性蛋白磷酸酶1-JNK1/2信號通路抑制缺血再灌注損傷誘導的AC16心肌細胞存活抑制和凋亡。在心臟缺血再灌注損傷中具有保護作用的USP49可能成為防治心肌缺血再灌注損傷的一個靶點。

2.4 USPs與心衰的病理生理機制 心衰的發生發展涉及復雜的病理生理學機制，包括神經體液激活、心肌肥厚、心室重構、體液因子改變及炎癥等。心肌肥厚是心臟后負荷增高時的主要代償機制，病理性心肌肥厚多由應激反應或疾病引起，可以獨立預測各種CVD。因此，尋找新穎且有效的防治心肌肥厚的靶點日益突出[32-33]。有研究表明正常心臟中USP4高表達，而人衰竭心臟和小鼠肥厚心臟中其水平持續降低。體外研究表明，內源性USP4的缺乏可促進體外血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大，而USP4的恢復可有效緩解這種促肥大作用。在體內研究中，USP4全敲除壓力超負荷誘導的小鼠心肌肥厚和纖維化加重，而心臟特異過表達USP4的小鼠病理性心肌肥厚有所改善。體內外研究的一致性說明USP4具有減輕病理性心肌肥厚和心衰的作用，而USP4對心肌肥厚的保護作用主要依賴于其去泛素化活性導致的TAK1-(JNK1/2)/p38信號通路的抑制。在腹主動脈縮窄誘導的左心室肥厚模型中，大鼠左心室組織中USP14表達增加，在血管緊張素Ⅱ誘導的初生大鼠心肌細胞肥大模型中，USP14表達也增加，且證實USP14的含量在心肌肥厚各個階段都有升高。研究也表明USP14可通過促進糖原合成酶激酶3β磷酸化，來促進心肌肥厚的發展[34]。Isumi等[35]通過對USP15過表達的轉基因小鼠心臟的研究發現，USP15去泛素化骨骼肌LIM蛋白1 并與其相互作用可導致心臟重構、心臟體積增大，說明USP15參與了心肌肥厚的調控。研究表明無論是在擴張型心肌病病人的心臟，還是壓力超負荷誘導的肥厚性小鼠心臟及血管緊張素Ⅱ刺激48 h后的新生大鼠心臟，USP18的表達都是升高的。并且驗證了同非轉基因小鼠相比，心肌細胞特異性過表達USP18的小鼠心臟有下列特點：心臟擴張和衰竭延緩，心肌肥厚、病理性纖維化減輕。而USP18過表達抑制心臟重構和延緩心臟功能障礙的過程依賴于TAK1的p38和JNK1/2信號通路的阻滯[36]。Wang等[37]發現主動脈弓橫向縮窄后的小鼠心臟和血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚小鼠心臟以及尸體解剖獲得的人類肥厚和衰竭心臟，CYLD的表達皆上調，而敲除CYLD的主動脈弓橫向縮窄小鼠的心肌肥厚、纖維化、凋亡、氧化應激和功能障礙程度均減輕。并進一步證明CYLD能夠抑制細胞外調節蛋白激酶(ERK)、p38/AP1和c-Myc/Nrf2通路的激活，從而加重心臟氧化應激。

這些研究表明，USPs通過各種通路或改善或促進心肌肥厚，影響著心衰的發生發展過程，這些影響使得USPs可能成為治療心衰的有效靶點。

3 總結與展望

USPs與心臟的正常電生理活動、AS、心肌缺血再灌注損傷、心衰的病理生理過程等息息相關，通過多種信號通路參與CVD的發生發展，為我們研究CVD提供了新的思路。通過調控USPs及其參與的各種信號途徑，有望成為防治CVD的新措施。USPs在心衰病理生理過程中的作用也使得其可能成為心衰的一個新型標記物。但是，USPs是否通過影響其他信號通路作用于CVD，以及已經發現的相關信號通路的潛在機制仍有待進一步闡明。另外，USPs的其他子成員在CVD中是否也有著相似的作用也需要我們進一步探索。總之，現有的研究表明USPs為血脂異常、AS、心肌缺血再灌注損傷及心衰的診治提供了可能。