KIR2DL4基因多態性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中的表達及與預后的相關性研究

朱文怡 李生君 候倩倩

白血病是一種血液系統的惡性腫瘤，老年白血病具有起病隱匿、初始癥狀不典型、伴有多種基礎疾病等特點。老年白血病病人臨床治療時，容易發生感染或出血，骨髓抑制期相對較長，因此臨床死亡率較高[1]。KIR2DL4基因是殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因家族中的功能型結構基因，其等位基因多態性水平豐富，且在老年白血病中的分布、檢出率存在差異[2]。而KIR2DL4基因發揮作用依賴于相應配體的存在，KIR2DL4與非經典HLA-G分子配位[3]。有研究表明，急性髓系白血病及慢性淋巴細胞白血病病人細胞異常表達HLA-G分子，且伴有促凋亡基因HtrA2水平升高，其表達水平能反映白血病病人疾病嚴重程度，可指導臨床治療[4]。既往研究表明，白血病病人伴有促凋亡基因HtrA2表達水平異常，能加劇病情的發展[5]，但是二者具體關系尚未闡明。本研究探討KIR2DL4基因多態性及促凋亡基因HtrA2在白血病病人中的表達及與預后的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月至2018年1月老年白血病病人156例為觀察組，其中男82例，女74例，年齡60～83歲，平均(75.39±4.51)歲；病程1～7個月，平均(3.59±0.56)個月。急性淋巴細胞白血病(ALL)67例，急性髓系白血病(AML)60例，慢性髓系白血病(CML)29例。選擇同期健康體檢的老年人79例為對照組，男40例，女39例，年齡60～84歲，平均(74.68±4.50)歲，2組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入、排除標準 納入標準：(1)符合老年白血病診斷標準[6]，且病人均經骨穿等檢查確診；(2)接受常規化療等治療，且病人均可耐受；(3)能完成KIR2DL4基因多態性及促凋亡基因HtrA2檢測。排除標準：(1)合并精神異常、血液系統疾病、器質性疾病者；(2)合并認知功能障礙、自身免疫系統疾病或其他部位惡性腫瘤者。本研究獲得醫院倫理委員會批準，病人和(或)家屬簽署同意書。

1.3 方法

1.3.1 儀器與設備：RNA提取試劑、DL2000 DNA Marker、實時熒光PCR擴增儀(型號：480II，瑞士Liggter Cycer公司)、反轉錄試劑盒、SYBR實時熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；Mag Bind EZ Pure kit試劑盒(美國OMEGA Biltck公司)。

1.3.2 標本采集：觀察組入院后次日取外周空腹靜脈血5 mL，對照組體檢當天取外周空腹靜脈血5 mL，離心30 min，速度為3500 r/min，血清分離完畢后放置在-80℃冰箱中，備用。

1.3.3 KIR2DL4基因多態性檢測：(1)DNA提取。取上述分離的血清標本，采用Mag Core提取試劑盒與Mag Core HF16 DNA純化自動工作站完成DNA的提取，控制最終DNA濃度50～100 ng/μL。(2)基因分型測序。根據設計的引物對KIR2DL4基因引物序列完成編碼(正向引物: 5′-TGGTGGGCCGCAGAACATGTGC-3′；反向引物: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′)，并對全部區域完成特異性PCR擴增。采用Mag Bind EZ Pure kit試劑盒完成磁珠純化，并以PCR產物作為測序模板，完成正向、反向測序(采用NaOAc/EDTA、乙醇等進行純化)。取最終獲得的純化測序產物，加入甲酰胺溶液13μL， 2 min變性，溫度95℃，在ABI370 DNA測序儀上進行電泳，并將獲得序列導入Assign4.7 SBT分析軟件排查錯誤堿基，確定KIR2DL4基因多態性(包括2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011、9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4)[6]。

1.3.4 促凋亡基因HtrA2檢測：(1)提取總RNA，反轉錄合成cDNA。取上述分離的血清標準，參考RNAison Plus說明書提取單個核細胞總RNA，取上述RNA提取液，完成瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀上進一步確定RNA是否完整；紫外分光光度計進一步檢測RNA(A260/A280控制在1.8～2.0)，控制RNA濃度為1～2 g/L，根據反轉錄說明書完成cDNA的合成。(2)檢測方法。采用實時熒光定量PCR測定2組促凋亡基因HrA2 mRNA水平，引物設計見表1。設置PCR參數：30 ℃ 10min；42 ℃ 30 min；99 ℃ 5 min；5 ℃ 5 min，連續進行35個循環，72 ℃ 10 min延長，獲得最終產物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，以β-actin為內對照。

表1 引物設計

2 結果

2.1 觀察組與對照組KIR2DL4基因多態性比較 2組KIR2DL4基因多態性中2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011差異無統計學意義(P>0.05)；觀察組9A型KIR2DL4高于對照組，10A型KIR2DL4低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組與對照組KIR2DL4基因多態性比較(n)

2.2 觀察組與對照組HtrA2 mRNA水平比較 觀察組HtrA2 mRNA水平高于對照組(P<0.05)；觀察組中不同疾病分型病人HtrA2 mRNA水平差異無統計學意義，見表3。

表3 觀察組與對照組HtrA2 mRNA水平比較

2.3 KIR2DL4基因多態性及HtrA2 mRNA表達與老年白血病病人預后的關系 對老年白血病病人進行2年隨訪，隨訪期間死亡病人54例，死亡率為34.62%。死亡組與存活組2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008多態性差異無統計意義(P>0.05)；死亡組9A型KIR2DL4檢出率、HtrA2 mRNA表達量均高于存活組(P<0.05)，10A型KIR2DL4檢出率低于存活組(P<0.05)，見表4。

表4 存活組與死亡組各個基因多態性比較

2.4 老年白血病病人預后影響因素的Cox回歸分析 將年齡、性別、疾病分型納入Cox回歸模型校正，對老年白血病病人預后因素進行分析，結果表明：老年白血病病人預后與2DL4-006、9A型KIR2DL4基因多態性、HtrA2 mRNA表達量均有關(P<0.05)，見表5。

表5 老年白血病病人預后影響Cox回歸分析

3 討論

KIR2DL4基因是一種結構基因，能與HLA-G配位，傳遞、抑制信號，亦可抑制NK細胞活性，是腫瘤細胞逃逸NK細胞免疫監控機制之一[7]。有研究結果表明：肥大細胞表面的抑制性KIR2DL4受體與HLA-G分子相互作用，能提高腫瘤細胞的侵襲性[8]。本研究中，觀察組老年白血病病人2DL4-0011、9A型KIR2DL4低于對照組(P<0.05)； 10A型KIR2DL4高于對照組(P<0.05)，說明KIR2DL4基因在老年白血病病人中表達異常。通常來說，KIR2DL4基因配位的非經典HLA-G分子，除了在孕婦的滋養層細胞膜表面表達外，在其他正常細胞中表達較低或不表達。老年白血病病人9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4等位基因表達產物功能上存在明顯的差異性，從而影響NK細胞對于白血病的殺傷、清除作用，導致老年白血病病人遠期預后較差，死亡率相對較高[9]。

細胞凋亡是基因調控的一種主動死亡方式，亦是細胞有機調控機體發育、維持內環境的重要機制。本研究中，觀察組HtrA2 mRNA水平高于對照組(P<0.05)，說明HtrA2 mRNA水平在老年白血病病人中表達異常。HtrA2 是近年來新發現的由細胞核編碼的線粒體凋亡蛋白，主要存在于線粒體膜輸尿管，部分可定位于細胞核[10]。陳泓磊等[11]研究表明，HtrA2 在乳腺癌、前列腺癌及胃癌中表達較低，但是在白血病病人中呈高表達，與本研究結果相符。進一步分析KIR2DL4基因多態性及促凋亡基因HtrA2與老年白血病病人預后的關系，結果表明：老年白血病病人死亡組與存活組KIR2DL4基因多態性中9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4和HtrA2 mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)。Cox回歸分析結果表明：老年白血病病人預后與KIR2DL4基因多態性及HtrA2 mRNA水平有關，說明KIR2DL4基因多態性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中存在異常，且與病人預后關系密切，測定KIR2DL4基因多態性及促凋亡基因HtrA2表達能評估病人預后，為病人治療提供依據和參考[12]。