魯雨,周豐武,鐘文輝,劉麗,李小方,鄧歡*
(1.南京師范大學環境學院,南京 210023;2.南京師范大學地理科學學院,南京 210023;3.江蘇省物質循環與污染控制重點實驗室,南京 210023;4.中國科學院遺傳與發育生物學研究所農業資源研究中心,石家莊 050022)
在土壤及沉積物環境中普遍含有產電細菌和有機質“燃料”,因此在土壤中構建微生物燃料電池(MFC)可原位產生少量電能。如果能提高土壤MFC的產電能力,實現在野外驅動傳感器運行、發射救援信號等用途,將具有廣闊的應用前景[1]。土壤MFC陽極位于淹水土壤中,陰極位于上覆水中。土壤中的產電細菌分解有機質,并將電子傳遞給胞外的陽極,電子通過導線到達陰極,與上覆水中的溶解氧發生還原反應。在這一過程中,細菌細胞內的NADH作為電子供體,O2作為電子受體,從而在土壤MFC導線上形成電流。陽極反應為NADH=NAD++H++2e,φ=-0.32 V;陰極反應為O2+4H++4e=2H2O,φ=+1.229 V。因此以O2作為電子受體時,MFC的理論最大電勢差約為1.55 V。但由于土壤MFC內阻較高,土壤有機質含量和產電細菌數量有限,其開路電壓遠低于1.55 V。Deng等[2]以碳布作為電極材料在淹水土壤中構建土壤MFC,其中單個MFC開路電壓約為500 mV;為了提高土壤MFC的電壓輸出,Wolińska等[3]向土壤中添加葡萄糖等不同碳源;Yu等[4]采用Fe3O4修飾陽極。當土壤MFC電路上連接1 000 Ω負載時,采用上述措施僅能獲得300 mV左右的輸出電壓。因此,要讓土壤MFC輸出1 V以上電壓,實現驅動小功率電器,需要串聯多個土壤MFCs。本課題組以碳氈作為陽極,鉑網作為陰極構建土壤MFC,并將3個土壤MFCs串聯,實現了最高1.596 V的輸出電壓和144.16 μW的輸出功率,驅動電子鐘穩定運行80 h[5],初步實現了土壤MFC驅動小功率電器的目標。但目前涉及土壤MFC發電的研究較少,而基于有機廢水、河流和海洋底泥的MFC通過串聯實現驅動小型傳感器[6-8],有望在所屬的環境中實現原位供電。土壤MFC存在內阻較高,以及串聯電池引發電壓反轉和陽極性能有限等問題[9],需要加以解決,才能進一步提升土壤MFC產電能力,實現更長時間穩定驅動小功率電器。另外,考慮到傳統的碳基材料如碳紙、碳布、碳氈等質地柔軟,用于構建土壤微生物燃料電池時,需要挖開土壤進行埋設[10],增加了操作的復雜性。因此,研究者主要對產電性能和MFC裝置實用性兩個方向進行改進:一方面通過改進陽極材料,提升陽極導電性、比表面積、孔隙率[11],從而顯著提高土壤MFC產電能力[12-15]。另一方面,使用硬質的陽極材料,便于直接插入土壤產電,提高土壤MFC的實用性。
本研究的目的是:闡明作者發明的石墨-無機硅膠復合陽極以及土壤MFC的產電性能,包括長時間穩定驅動小功率電器的能力;揭示陽極表面活躍的產電細菌組成,回答“誰在產電”的問題。為了實現上述目的,本研究將石墨-無機硅膠復合陽極(專利公開號CN110943230A)[16]埋設在水稻土中,鉑網作為陰極置于上覆水中構建并運行土壤MFC。將兩個土壤MFCs串聯驅動一臺電子鐘穩定運行30 d,之后對土壤MFC進行電化學指標檢測,包括陽極電荷傳遞電阻、極化曲線和最大功率密度。檢測結束后,提取陽極表面土壤的RNA,對反轉錄后的16S rRNA進行測序,從屬的水平上揭示土壤中活躍的產電細菌組成和多樣性。
2018年7月于南京市江寧區水稻田(32°05′18″N,118°28′59″E)進行土壤樣品采集(深度0~20 cm)。土壤采集后研磨過2 mm篩并充分混勻,土壤過篩后保存在4℃冰箱中,用于后續“土壤微生物燃料電池構建和運行”實驗,部分過篩的土壤經風干后進行理化分析[17]。土壤pH采用pH計(FE20,Mettler Toledo,Switzerland)按土水比1∶2.5測定;土壤電導率采用電導率儀(DDSJ-308F,上海雷磁)按土水比1∶5測定;土壤可溶性有機碳采用TOC分析儀(TOC-L,Shimadzu,Kyoto,Japan)測定;土壤總氮采用元素分析儀(Vario ELⅢ Elementar,Germany)測定。土壤理化性質如下:土壤pH 7.26,土壤電導率105.41 μS·cm-1,土壤可溶性有機碳162.55 mg·kg-1,土壤總氮2.98 g·kg-1。
將厚2 mm的碳氈切割成0.5 cm×1.0 cm的長方體,在10%的H2SO4溶液中浸泡30 min,酸洗完成后在去離子水中超聲清洗30 min;置于廣口玻璃瓶中60℃干燥2 h。稱取處理后的碳氈0.1 g置于50 mL密度為1.50 g·cm-3的硅酸鈉溶液中,使用電動攪拌機(TH-A 100 W,常州國宇儀器)攪拌20 min,超聲分散成碳纖維。稱取16 g 3 000目的石墨粉(貨號C-01-1,戈貴金屬)加入上述溶液中,攪拌混勻30 min得到無機硅膠-石墨混合溶液。將所得無機硅膠-石墨混合物注入圓柱形硅膠模具(直徑5 cm,高度10 cm),室溫不低于25℃條件下放置于通風處24 h。
向無機硅膠-石墨混合物中垂直插入6根長度10 cm鈦絲,間距1.5 cm,放入烘箱程序性升溫,加熱固化。升溫程序為:40℃加熱6 h,80℃加熱1 h,120℃加熱4 h,自然冷卻至室溫。固化物置于30%硫酸中浸泡12 h。于40 Hz條件下在去離子水中超聲清洗4次,得到石墨-無機硅膠復合陽極。采用掃描電鏡(JSM-5610 LV,Japan)觀察陽極材料斷面的微觀結構,用精密蝕刻涂層系統斷面噴金,加速電壓25 kV[18]。采用比表面與孔隙度分析儀(Micromeritics ASAP2050,US)檢測電極材料的比表面積。
在兩個PE材質容器(直徑30 cm,高度25.5 cm)中分別構建土壤MFC,命名為MFC1、MFC2。過程如下:每個容器裝入10 kg土壤(干土質量),緩慢加水至水面高于土壤表面7 cm。將1.2中制備的無機硅膠-石墨復合陽極插入淹水土壤中,陽極上表面位于土壤表面以下3 cm處。陰極(鉑網,直徑4.5 cm)浸沒于上覆水中。采用便攜式溶解氧儀(JPBJ-608,上海儀電)檢測上覆水中溶解氧濃度,為6.51 mg·L-1。每個土壤MFC的陽極和陰極連接1 000 Ω的外阻,馴化產電細菌,電壓穩定后去掉外阻并串聯MFC1和MFC2。當串聯MFCs的開路電壓(OCV)高于1.5 V時,連接電容(1 F)充電。充電完成后將電子計時器(額定電壓1.0 V,額定功率18 μW)與電容并聯,計時器開始運行(圖1)。在室溫下土壤MFC驅動計時器連續運行30 d,使用數據采集卡(7660B,北京中泰研創)每15 min記錄一次電壓數據;采用電子溫度計(T12R-EX,深圳英斯特)每2 h記錄一次氣溫數據。電子計時器運行30 d后,斷開電路進行電化學性能測試并提取陽極表面土壤的RNA。
電子計時器運行結束后,按從高到低的順序(20、10、5、1 k和500、100、50、10 Ω)依次改變單個MFC和串聯MFCs的外阻,獲得單個MFC和串聯MFCs的極化曲線和功率密度曲線[19]。電流密度j(mA·m-2)和功率密度P(mW·m-2)按下列公式計算:

式中:U為電壓,V;R為外電阻,Ω;I為電流,A;A為陽極的表面積,m2。
采用電化學工作站進行電化學阻抗譜分析(Versa STAT4,Princeton applied research,Oak Ridge,US),檢測單個MFC的陽極電荷傳遞電阻。將陽極作為工作電極,陰極作為對電極和參比電極[20]。EIS參數為頻率范圍10 m~100 kHz,振幅10 mV。采用ZSimDemo 3.30軟件選擇等效電路擬合Nyquist曲線,獲得陽極電荷傳遞電阻阻值。

圖1 串聯的土壤微生物燃料電池(MFC1和MFC2)Figure 1 Serially connected soil microbial fuel cells(MFC1 and MFC2)
電化學性能測試結束后,采用RNA快速提取試劑盒(Fast RNA SPIN Kit for Soil,MP)從陽極表面土壤中提取RNA。提取完成后采用27F∕907R引物進行PCR,確認RNA中不含DNA[21]。RNA提取后立即反轉錄成 cDNA。10 μL 反轉錄體系中含有 2 μL 5×PrimeScript?RT Master Mix,1 μL 總 RNA 和 7 μL 無RNase蒸餾水。該體系在37℃下培養15 min,升溫至85℃維持5 s,使逆轉錄酶失活,提取的cDNA使用前保存在-80℃冰箱中。
采用引物515F(5′-GTG CCA GCM GCC GCG G-3′)∕907R(5′-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3′)對反轉錄后的16S rRNA V4~V5區域進行PCR擴增[22]。PCR體系的體積為 25 μL,包括 1 μL DNA 模板、各1 μL上下游引物、2.5 μL 10×buffer(含Mg2+)、4 μL 10 mmol·L-1dNTPs(每種各 2.5 mmol·L-1)以及 2.5 U Taq酶。熱循環條件95℃3 min。40個循環擴增包括95 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s[23],電泳觀察擴增產物。在Illumina Miseq平臺(上海美吉)對反轉錄后的16S rRNA V4~V5區域進行高通量測序。
陽極表面產電細菌多樣性評估使用Richness物種豐富度(S)、Shannon-Wiener指數(H′)、Chao1(C)指數為參數,計算公式如下:

式中:n為個體數(豐度)大于0的物種類型總數;pi為物種i的相對豐度;F1為僅包含1個個體的物種數;F2為僅包含2個個體的物種數。

圖2 復合陽極材料的SEM圖像(×700倍)Figure 2 SEM image of composite anode material(×700 times)
土壤MFC陽極的掃描電鏡結果顯示,石墨-無機硅膠復合陽極結構呈堆疊蜂窩狀,石墨片間有碳纖維連接(圖2)。陽極材料比表面積為31.85 m2·g-1。陽極表面產電細菌馴化42.5 h后土壤MFCs電壓達到穩定水平,其中MFC1和MFC2的1 000 Ω外阻兩端電壓分別為(242.2±1)mV和(191.4±1)mV(圖3);開路電壓分別為770.9 mV和648.6 mV。MFC1和MFC2串聯初始的開路電壓為1 407.9 mV。串聯48 h后,串聯MFCs的開路電壓逐漸上升到1 540.1 mV。此時,采用串聯MFCs對一個電容(1 F)進行充電。電容連接到MFCs后,串聯開路電壓急劇下降至183.9 mV,隨后逐漸上升。電容充電15.25 h后,串聯MFCs的電壓上升到1 487.3 mV。將一個電子計時器與電容及串聯MFCs并聯(圖1),此時串聯MFCs及電容同時為電子計時器供電,驅動其連續穩定計時30 d(2019年9月28日—2019年10月28日),期間MFCs串聯電壓一直穩定在1 403.3~1 579.9 mV,室內溫度變化范圍為15.5~31.1℃。

圖3 MFCs的電壓曲線Figure 3 Voltage curves of MFCs in four stages
圖4 為MFC1和MFC2陽極內阻的Nyquist圖以及等效電路圖。MFC1和MFC2的陽極等效電路都為歐姆內阻(RΩ)串聯電容(C)和陽極電荷傳遞電阻(Rct)的并聯電路。通過等效電路計算出MFC1和MFC2陽極電荷傳遞電阻分別為16.46 Ω和16.80 Ω,歐姆阻抗分別為102.00 Ω和102.50 Ω。
圖5為MFC1、MFC2以及串聯電路極化曲線和功率密度曲線。MFC1和MFC2負載1 000 Ω外阻時達到最大功率密度,分別為3.54 mW·m-2和2.39 mW·m-2。MFC1和MFC2串聯電路負載5 000 Ω外阻時,達到最大功率密度5.45 mW·m-2。
基于16S rRNA的測序結果(圖6)表明,MFCs陽極表面的土壤中有14個活躍的產電細菌相關屬,包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、梭菌屬(Clostridium)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、地發菌屬(Geothrix)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、地桿菌屬(Geobacter)、不動桿菌(Acinetobacter)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、大腸桿菌屬(Escherichia),以及Thermincola和Geoalkalibacter。表1顯示產電細菌相關屬的多樣性指數。MFC1和MFC2陽極上產電細菌相關屬的16S rRNA數量占全部細菌的5.97%和4.97%。在至少一個MFC中,占產電細菌相關屬16S rRNA總量10%的產電細菌相關屬包括地桿菌屬(Geobacter)(MFC1中占32.59%,MFC2中占 19.54%)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(MFC1中占25.46%,MFC2中占 41.97%)、梭菌屬(Clostridium)(MFC1中占6.97%,MFC2中占12.60%)、脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)(MFC1中占 12.32%,MFC2中占8.98%)和假單胞菌屬(Pseudomonas)(MFC1中占11.45%)。

圖4 MFC1和MFC2的陽極Nyquist圖以及等效電路圖Figure 4 Nyquist plots and equivalent circuits for anodes of MFC1 and MFC2

圖5 MFC1、MFC2和串聯MFCs的極化曲線和功率密度曲線Figure 5 Polarization curves and power density curves of MFC1,MFC2 and serially connected MFCs

圖6 兩個土壤MFCs陽極中檢測到的活躍的產電細菌相關屬的相對豐度Figure 6 The relative abundance of the active exoelectrogenic bacteria-associated genera detected from the anodes of the two individual soil MFCs

表1 陽極表面土壤中的產電細菌多樣性指數Table 1 Exoelectrogenic bacteria diversity index of paddy soil on anode surface
本研究采用自主發明的一種石墨-無機硅膠陽極材料構建土壤MFCs,在淹水水稻土中利用產電細菌分解有機質產生的電能穩定運行電子計時器30 d。實現這一結果經歷了4個步驟,包括產電細菌的馴化、串聯土壤MFCs、電容充電,以及驅動電器。新型陽極材料的MFC性能在上述4個環節中均表現良好,相比于作者前期研究[3],本研究土壤MFCs的產電性能取得了以下進展:(1)陽極電荷傳遞電阻較低,且陽極比表面積較高,表明該陽極材料有利于產電細菌附著并具有較高的電子傳遞效率;(2)產電菌的馴化時間(55 h)遠低于作者前期研究中的110 h及其他MFC的馴化時間[24],且驅動電子計時器運行30 d,遠超出作者前期研究中的80 h;(3)采用兩個土壤MFCs串聯實現上述高產電性能,而作者前期研究需要3個土壤MFCs串聯,串聯MFCs數量的減少降低了電壓反轉的風險。除了產電性能優越之外,本研究發明的剛性陽極材料能直接插入底泥產電,操作方便;而以往研究[5,10]多采用柔軟的碳氈陽極,需要挖開底泥埋設后才能產電,操作繁瑣。以往研究也表明土壤長期產電不會造成土壤有機質的顯著降低[25],因此土壤MFC在水稻土中能夠長期穩定地驅動用電器。本研究串聯土壤MFCs開路電壓穩定在1.5 V左右,最大輸出功率158.42 μW,可運行該功率以下的小功率用電器,包括微瓦級低功耗傳感器及移動顯示器等。由于土壤內阻較高,且土壤中有機質含量和產電細菌數量有限,因此本研究獲得的最大功率密度受到限制。相同電極面積下,土壤MFCs的輸出功率遠低于基于液體培養基或者有機廢水的MFC的輸出功率(功率密度可達數百mW·m-2以上)[26]。但是土壤MFC的功率密度還可以進一步提升,措施包括在土壤中種植水稻(Oryza sativa)、互花米草(Spartina anglica)、狼尾草(Pennisetum setaceum)等禾本科植物以增加土壤有機質[27];在陰極表面附著小球藻(Chlorella vulgaris)以提高O2濃度[28];采用硼∕氮∕磷∕硫摻雜電極、納米材料電極、3D多孔電極等以促進陽極和陰極的催化反應[29]等。而且土壤MFC的優勢在于實現野外條件下的長時間原位供電,不用更換培養基和接種產電細菌;土壤MFC以土壤有機質為電子供體,水中的溶解氧為電子受體,發電過程產物是H2O,發電成本低、不產生污染。
電化學檢測結果顯示本研究采用的陽極電荷傳遞電阻小于17.0 Ω,遠低于采用碳氈作為陽極材料的陽極電荷傳遞電阻 36.03、77.10 Ω[5,30]。MFC 的產電性能和陽極電荷傳遞電阻直接相關,陽極作為產電細菌的載體,極大地影響微生物與電極之間的電子傳遞[31]。較低的電荷傳遞電阻有利于微生物將電能傳遞到用電系統中[32]。掃描電鏡圖像和產電細菌多樣性進一步表明本研究中采用的石墨-無機硅膠陽極材料具有蜂窩狀三維立體結構,以及較大的比表面積,有利于電極表面細菌的附著與生長,提高電子傳遞速率[33]。
串聯MFCs在運行過程中容易出現電壓反轉,導致串聯失敗[34]。電壓反轉的原因包括:內阻過高[35]、MFC長時間運行中底物缺乏[36]、微生物催化效果不佳[37]、電流密度過高[38]。本研究串聯MFCs運行的全過程中,未出現電壓反轉現象,這可能是在MFC與用電器之間使用電容器連接的原因。根據公式(6):

式中:U為輸出電壓,V;E為串聯MFCs的電動勢,V;I為電流,A;Rin為內阻,Ω。雖然本研究中陽極電荷傳遞電阻較低,但陰極受制于鉑催化O2得電子速率的影響,在作者團隊之前研究中多次測試得到陰極電荷傳遞電阻大約為400 Ω[39],因此經過串聯后土壤MFCs內阻至少達到800 Ω,遠高于一個干電池的內阻。若串聯土壤MFCs直接與計時器連接,當電流產生時,會出現劇烈壓降,甚至電壓變負,導致驅動計時器失敗。采用電容器可以儲存電能是一種避免電壓反轉,實現MFC正常驅動電器的有效方法。
產電細菌是MFC系統中電能的直接生產者。土壤中的產電細菌通過細胞色素c等多種蛋白將分解有機質產生的電子跨膜傳遞至陽極表面。在胞外電子傳遞過程中,產電細菌既可以通過直接電子傳遞方式,也可以通過分泌中介體等間接電子傳遞方式將電子傳遞到陽極表面[40-41],產電細菌活性直接影響MFC的產電性能[42]。由于至今尚未發現產電細菌共有的特征基因,因此無法借助通用引物和PCR來揭示產電細菌多樣性。以往大多數研究采用模式產電細菌地桿菌屬(Geobacter)和希瓦氏菌屬(Shewanella),或者地桿菌科(Geobacteraceae)來代表所有產電細菌[43-44]。而作者團隊曾經從不同的土壤中分離鑒定了11株屬于梭菌屬(Clostridium)的產電細菌[25],并且基于16S rRNA基因的定量分析顯示在土壤中,梭菌屬和地桿菌屬的細菌數量相當,相反,希瓦氏菌屬在土壤中數量很少[17,23]。目前為止,已報道約100種產電細菌菌種,分布于57個屬[45-46]。作者團隊將這57個屬定義為產電細菌相關屬,通過對全國范圍不同土壤16S rRNA基因測序,發現土壤中含有16個產電細菌相關屬,實現從屬的水平揭示產電細菌的組成[23]。盡管這一方法存在一定偏差,例如一些產電細菌相關屬中只有一部分菌種被鑒定為產電細菌。但該方法仍能近似表征土壤產電細菌組成和多樣性,相比僅用地桿菌科來代表土壤產電細菌前進了一大步。本研究發現陽極表面土壤中的活性產電細菌相關屬共14個,高于作者先前碳氈陽極研究中發現的10個產電細菌相關屬[5]。產電細菌相關屬的多樣性的提高表明石墨無機硅膠陽極有利于產電細菌的附著和生長。本研究兩個土壤MFCs的產電細菌多樣性以及電化學性能并不完全一致,主要是土壤和MFC裝置的誤差所致。
石墨無機硅膠陽極表面的土壤中,最主要的活性產電細菌相關屬包括地桿菌屬(Geobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。在之前的研究中對全國8個不同地區(其中包括本研究的采樣地)水稻土中產電細菌相關屬進行了16S rRNA基因測序,發現地桿菌屬(Geobacter)、梭菌屬(Clostridium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)在數量上是優勢產電菌群,而芽孢桿菌屬(Bacillus)數量上并不占優勢[23]。但是本研究經過30 d的產電過程,芽孢桿菌(Bacillus)和地桿菌(Geobacter)成為陽極表面最活躍的產電細菌相關屬,表明這兩個屬具有較高的產電活性。其中,地桿菌屬(Geobacter)的大量菌種已被確定為產電細菌且在水稻土中廣泛存在,包括G.anodire-ducens、G.bemidjiensis、G.bremensis、G.chapellei、G.humireducens、G.hydrogenophilus、G.lovleyi、G.metallireducens、G.sulfurreducens和G.uraniireducens[44]。芽孢桿菌屬(Bacillus)中已獲報道的產電細菌為B.subtilis、B.infernus和B.thermoamylovorans[47],其中B.subtilis已從水稻土中分離培養[48]。屬于梭菌屬(Clostridium)的產電細菌包括C.acetobutylicum、C.beijerinckii、C.butyricum、C.propionicum和C.sporogenes,這些菌種都存在于水稻土中[49];屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的產電細菌包括P.aeruginosa、P.alcaliphila、P.fluorescens和P.stutzeri。除P.alcaliphila之外,其他3個菌種都從水稻土中獲得分離[50-52]。脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)中目前僅報道一種產電細菌D.propionicus,存在于淡水沉積物中[53]。由于不可培養的原因,目前所發現的產電細菌菌種也許只占所有產電細菌的極少部分。土壤作為微生物的“大本營”,有望從其中分離出更多的產電細菌菌株。
土壤及沉積物中的產電細菌展現出多種潛在應用,除了原位驅動小功率電器[5,8]之外,還能夠產生電信號原位在線監測污染事件[17,54],以及用于環境修復,例如脫硫弧菌還原鉻(Ⅵ)[55];地桿菌、芽孢桿菌和假單胞菌還原鈾(Ⅵ)、釩(Ⅴ)等[56-58]。對這些潛在應用加以進一步探索,有望在新能源、環境監測和修復領域產生新技術。
本研究發明的石墨-無機硅膠復合陽極的電荷傳遞電阻約為16 Ω。以該陽極構建的單個土壤MFC最大功率密度約為3 mW·m-2,兩個土壤MFCs串聯電路的最大功率密度為5.45 mW·m-2,最大輸出功率158.42 μW,最高輸出電壓1 579.9 mV,實現驅動電子計時器穩定運行30 d,因此石墨-無機硅膠復合陽極適用于土壤MFC。同時本研究土壤中活躍的產電細菌相關屬有14個,其中地桿菌屬(Geobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)為最活躍的產電細菌相關屬。