水產養殖尾水初沉區中凈化材料的應用對微生物酶活性的影響

楊曉曦，吳偉，施羽露，王鈺欽，錢信宇，鄭堯,2*，陳家長,2*

（1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫 214081）

養殖尾水是指水產養殖過程中或養殖結束后，由養殖體系（包括養殖池塘、工廠化車間等）向自然水域排出的不再使用的養殖水。本課題組基于“三級循環水理論”[1]構建“兩壩三區”尾水處理系統[2-3]，兩壩包括溢流壩、潛流壩，三區包括初沉區、初級凈化區、次級凈化區。兩壩主要對未消化的飼料和懸浮物進行過濾沉淀，初沉區為因地制宜利用的排水溝或不規則的池塘，通常是凈水處理系統中的第一個單元，主要作用是降低水中懸浮物濃度及其攜帶的營養鹽。目前關于水產養殖過程壩體和生態溝渠中水質凈化材料篩選的研究不多，課題組前期室內模擬初沉區篩選出水質處理效果較好的兩種凈化材料：除氮型改性凹凸棒土（Al@TCAP-N）和火山石。其中，改性凹凸棒土是在凹凸棒土的基礎上進行改性，以擴大孔隙，增大比表面積[4]。Yin等[5]將Al@TCAP-N用于黑臭水體的底泥修復，發現其能有效降低沉積物中TN和TP的含量。而火山石具有多孔結構，比表面積大，研究表明其具有較好的TN、TP和CODMn去除效果[6]。但是該系統存在尾水集中排放期間和冬季因植物生長緩慢、微生物代謝能力弱導致吸收能力降低的問題。因此在實際應用中，常利用載體吸附和微生物凈化雙重作用強化凈化水質的目的。

從微生物強化水質凈化效果方面看，芽孢桿菌[7]和活性污泥[8]在水處理中去除氮、磷和有機物的效果好。凈化材料表面覆著大量微生物，能分泌分解和轉化營養鹽的酶類物質，但目前從酶活性角度對微生物強化水質凈化效果的機制研究較少。微生物通過分泌酶參與到物質代謝途徑，如微生物氨單加氧酶（Ammonia monooxygenase，AMO）[9]參與氨氧化反應，微生物亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NIR）[10]參與亞硝化反應，微生物硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase，Nar）[11]誘導硝態氮的轉化過程；微生物有機磷水解酶（Organic phosphorus hydrolase，OPH）[12]可以分解有機磷，微生物堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）[13]催化分解有機磷；而微生物脫氫酶（Dehydrogenases，DHO）[14]通過傳遞有機物的氫從而分解有機物。為探究代謝酶類發揮的營養鹽去除功效，本試驗室內模擬養殖尾水處理系統初級沉淀單元，通過添加外源微生物，分析氮循環、有機磷分解和有機物分解相關酶活性，材料表面富集水質相關細菌、真菌的差異變化及其和水質指標的相關性，研究尾水凈化材料Al@TCAP-N和火山石的應用對微生物功能酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

材料來源：試驗用吉富羅非魚養殖尾水取自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心養殖池塘。Al@TCAP-N由中國科學院南京地理與湖泊研究所提供；火山石購自廣州花地水族用品有限公司。活性污泥由海力士半導體（無錫）有限公司提供，通過好氧反硝化活性污泥培養基[15]擴增；外源微生物中地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）菌粉、復合芽孢桿菌菌粉來自本實驗室，通過LB培養基擴增，擴增后的菌液于4℃冰箱保存備用（保證濃度≥109CFU·mL-1），使用前等比混合得到混合菌液。NIR、Nar、DHO、OPH、AMO和AKP試劑盒由上海摩楷生物科技有限公司提供。

外源微生物用量確定及室內模擬初沉區：在2 000 mL三角瓶中（按養殖尾水200 L計算）按2 mL·m-3添加濃度為1×109CFU·mL-1的菌液，加充分混勻后的養殖尾水稀釋到800 mL，再加入試驗所需的凈化材料600 g，在振蕩培養器中30 ℃、150 r·min-1培養24 h后取出凈化材料待用。為保證微生物的豐富度，復合菌液采用3種擴增菌液等比例混合。火山石和Al@TCAP-N用網袋包裹，按1∶1的比例，放置于沉淀單元模擬系統底部（長方形有機玻璃材質，有效體積為250 L），并按2 mL·m-3添加濃度為1×109CFU·mL-1的混合菌液。

樣本采集：①檢測酶活和水質指標的水樣樣本，試驗開始后0、6、12、24、36 h和48 h采集兩種材料周圍水體（下0.15 m，左右直徑0.3 m處）水樣，取上述取樣點對應組的材料，按 1∶9（m∶V）添加 0.01 mol·L-1PBS緩沖液，浸泡30 min采用超聲處理離心到100 μL。按質量比1∶10使用0.01 mol·L-1的PBS緩沖液稀釋，并于20 kHz、4℃條件下超聲處理5 min，然后于4℃、12 000g條件下離心10 min，取上清液使用試劑盒進行測定；②檢測微生物的樣本，采集凈化材料表面微生物置于50 mL離心管，儲藏于-80℃冰箱中，采用高通量手段測定凈化材料表面微生物群落中細菌和真菌的主要門類。為減少取樣所帶來的系統誤差，每個時間點對3個平行組樣本進行采樣。

1.2 材料內外酶活、水質檢測與微生物分析

酶活檢測：參考上海摩楷生物科技有限公司試劑盒說明書采用雙抗體夾心法檢測，通過固相抗體、酶、酶抗體的結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。經過染色、酶催化、酸化步驟后用酶標儀測定吸光度（OD值）。

水質指標測定：試驗過程中的水溫維持在28±2℃并采用加熱棒進行控制，pH維持在6.9±0.3，采用NaHCO3進行調節，硬度碳酸鈣指數維持在350±12，溶氧＞5 mg·L-1。參照《水質總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》（GB 11894—1989）測定總氮（TN）含量，參照《水質總磷的測定鉬酸銨分光光度法》（GB 11893—1989）測定總磷（TP）含量，參照《水質高錳酸鹽指數的測定》（GB 11892—1989）測定高錳酸鹽指數（CODMn）。

微生物檢測：基于北京百邁客生物科技有限公司PacBio測序平臺，利用單分子實時測序（SMRT Cell）的方法對marker基因進行擴增測序，之后通過對CCS（Circular Consensus Sequencing）序列過濾，得到Optimization-CCS 進行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構成。利用16S rDNA序列進行細菌種類分析，利用ITS序列進行真菌種類分析。Silva（release132）和Unite（release8.0）分別為細菌16S和真菌ITS比對數據庫。

1.3 數據分析

在Excel 2019軟件中完成數據處理，在Origin 9.4中進行相關圖形的繪制，在IBM SPSS Statistics 19中完成方差分析及均值LSD多重比較，差異顯著水平P＜0.05用不同小寫字母表示。

2 結果與分析

2.1 酶活性檢測結果

材料周圍水體中微生物AKP活性為191.58～234.15 IU·L-1（圖 1），火山石 AKP 活性為 218.49～265.07 IU·L-1，Al@TCAP-N 中 AKP活性為 200.82～257.98 IU·L-1。0～36 h，火山石中的AKP活性高于其他兩組；48 h時，Al@TCAP-N的AKP活性高于其他兩組。6 h火山石內和Al@TCAP-N內部AKP活性顯著高于凈化材料周圍水體中微生物的AKP活性。

材料周圍水體OPH活性為683.63～793.34 IU·L-1，火 山 石 OPH 活 性 為 668.13～763.61 IU · L-1，Al@TCAP-N 中 OPH 活性為 588.99～706.66 IU·L-1。0～6 h，火山石中的OPH的活性高于其他兩組；12～48 h水中的OPH的活性高于其他兩組。24 h時凈化材料周圍水體中微生物的OPH活性顯著高于Al@TCAP-N內部的OPH活性。

材料周圍水體DHO活性為1 921.71～2 502.94 IU·L-1，火山石DHO活性為1 717.23～2 397.9 IU·L-1，Al@TCAP-N中DHO活性為1 955.32～2 650.00 IU·L-1。0 h，火山石中的DHO活性高于其他兩組；6 h和36～48 h，Al@TCAP-N的DHO活性高于其他兩組；12～24 h，凈化材料周圍水體中微生物的DHO的活性高于其他兩組。在0 h，火山石內的酶活性顯著高于凈化材料周圍水體中微生物的DHO活性。6 h凈化材料周圍水體中微生物的DHO活性和Al@TCAP-N內DHO活性顯著高于火山石內的DHO活性。12 h凈化材料周圍水體中微生物的DHO活性顯著高于Al@TCAP-N內的DHO活性。36 h Al@TCAP-N內的DHO活性顯著高于火山石內和凈化材料周圍水體中微生物的DHO活性。48 h火山石內的DHO活性顯著低于Al@TCAP-N內的DHO活性。

材料周圍水體AMO活性為399.61～467.41 IU·L-1，火 山 石 AMO 活 性 為 359.89～438.44 IU ·L-1，Al@TCAP-N 中 AMO 活性為 363.47～422.61 IU·L-1。0 h和12～48 h，凈化材料周圍水體中微生物的AMO活性高于其他兩組；6 h時，火山石中的AMO活性高于其他兩組。6 h火山石內的AMO活性顯著高于凈化材料周圍水體中微生物的AMO活性。48 h凈化材料周圍水體中微生物的AMO活性顯著高于Al@TCAP-N內的AMO活性。

材料周圍水體Nar活性為1 035.79～1 271.68 IU·L-1，火山石中 Nar活性為 1 177.87～1 462.02 IU·L-1，Al@TCAP-N中Nar活性為1 142.35～1 328.14 IU·L-1。0～24 h，火山石中的Nar活性高于其他兩組；36～48 h，Al@TCAP-N中的Nar活性高于其他兩組。0、12 h和24 h火山石內的Nar活性顯著高于凈化材料周圍水體中微生物的Nar活性。

材料周圍水體NIR活性為546.7～672.77 IU·L-1，火山石中NIR活性為557.92～721.62 IU·L-1，Al@TCAP-N中NIR活性為482.34～734.16 IU·L-1。0 h和36 h，火山石中的NIR活性高于其他兩組；6、12 h和48 h，凈化材料周圍水體中微生物的NIR活性高于其他兩組；24 h，Al@TCAP-N中的NIR活性高于其他兩組。0 h火山石內的NIR活性顯著高于凈化材料周圍水體中微生物和Al@TCAP-N內的NIR活性。6 h凈化材料周圍水體中微生物的NIR活性顯著高于Al@TCAP-N內的NIR活性。48 h，凈化材料周圍水體中微生物的NIR活性顯著高于火山石內和Al@TCAP-N內的NIR活性。

2.2 水質凈化效果

圖1 不同酶活性變化情況Figure 1 Changes of different enzyme activities

添加凈化材料處理前（0 h），TN、TP和CODMn的含量分別為（3.12±0.01）mg·L-1、（1.41±0.04）mg·L-1和（15.02±0.28）mg·L-1（圖2）。凈化材料處理后（48 h）TN、TP和CODMn的含量分別為（2.59±0.06）mg·L-1、（1.33±0.03）mg·L-1和（10.72±0.23）mg·L-1。36 h TN的去除率最高，為（22.61±0.39）%，此時TN含量為（2.42±0.02）mg·L-1；36 h TP的去除率最高，為（9.52±1.04）%，此時 TP 含量為（1.30±0.02）mg·L-1；48 h CODMn的去除率最高，為（28.60±2.49）%，此時CODMn含量為（10.72±0.23）mg·L-1。

2.3 凈化材料表面微生物高通量分析細菌和真菌主要門類

材料表面微生物細菌主要為浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），外源添加的菌制劑和活性污泥的引入并未帶來水體和材料表面微生物主要類群的顯著變化（表1）。但通過分析發現，3種細菌門類在36～48 h空白組、吸附材料單獨處理組和凈化材料+外源微生物組中，Al@TCAP-N與空白組不同時間點間存在顯著性變化（圖3）。24 h，Al@TCAP-N內浮霉菌門占比高于空白組內浮霉菌門占比；空白組內變形菌門和擬桿菌門的占比高于Al@TCAP-N內上述兩種菌的占比。36 h，Al@TCAP-N內變形菌門的占比與空白組和火山石內變形菌門的占比存在顯著差異（表1）。而48 h，Al@TCAP-N內變形菌門的占比與凈化材料+外源微生物組內變形菌門的占比存在顯著差異；空白組內擬桿菌門的占比與凈化材料+外源微生物組內擬桿菌門的占比存在顯著差異。

所檢測的真菌中主要存在壺菌門（Chytridiomycota），但與水質相關的青霉（Penicillium）和曲霉（Aspergillus）也同時存在（表2）。其中，12 h，青霉達到占比的最高值，為（0.736 4±0.044 2）%；24 h，曲霉達到占比的最高值，為（0.026 6±0.001 3）%。

3 討論

3.1 凈化材料-微生物-水質之間的關系

圖2 TN、TP和CODMn的含量和去除率Figure 2 The contents and removal rates of TN，TP and CODMn

表1 36 h與48 h主要細菌門類對比（%）Table 1 Comparison between 36 h and 48 h of major bacteria（%）

表2 不同時間凈化材料內青霉和曲霉占比（%）Table 2 Proportion of Penicillium and Aspergillus in purified materials at different time（%）

凈化材料表面結構與水質處理效果密切相關，本試驗中火山石具有較大的比表面積，內部多孔隙；凹凸棒土進行改性后呈現出疏松多孔的結構[16]，研究表明兩者均具有較好的吸附能力[16-18]。凈化水體中添加外源微生物，可以有效降低水中氮磷含量，從而達到凈化水質的強化效果[19-20]。而活性污泥呈絮狀，含有大量微生物，具有脫氮除磷的功能，通常被用于生活污水處理領域[21]。市售的芽孢桿菌制劑具有異養硝化-好氧反硝化[19，22]和解磷[23]的作用，可以降低水體中營養鹽的含量[24]。在實際使用過程中，往往將幾種不同類型的凈化材料復配進行使用，增強對營養鹽的降解能力，有研究表明，復合凈化材料（火山石[25-26]和凹凸棒土[27]）與外源微生物聯合作用可顯著提高初級沉淀系統的水質凈化能力。本試驗中凈化材料內酶活性高于凈化材料外周圍水體中酶活性，外源微生物的加入雖未造成材料及其周圍水體中主要細菌門類的變化，但因凈化材料的加入可能會改變材料周圍的微環境[19，21]以利于微生物的富集，凈化材料內微生物含量可能因載體的存在高于凈化材料周圍水體中微生物含量。而外源微生物的加入能否帶來水質修復相關細菌及酶活性的變化？本試驗中檢測到的變形菌門中存在可以氧化氨的亞硝化細菌屬（Nitrosomonas）[28]，可以分泌氨單加氧酶（AMO），催化氨氧化反應。浮霉菌門和擬桿菌門[29]含有參與厭氧氨氧化的細菌，通過協助分泌亞硝酸鹽還原酶NIR將-N降解為NH3-N，生成N2。真菌中的青霉和曲霉被證實具有解磷作用[23]，通過分泌磷酸酶、核酸酶等，水解有機磷，且解磷能力通常比細菌強[30]。還有相關研究表明，相比于水環境，多孔隙結構會為微生物提供更穩定的生長環境，有利于酶積累、微生物培養和水質凈化[31-32]。凈化材料（Al@TCAP-N和火山石）表面附著生長的細菌和真菌會促進水中氮、磷的轉化，從而降低水體中TN、TP含量，達到改善水質的目的。且在36 h，Al@TCAP-N會促進變形菌門的生長，分泌AMO以促進氨氧化反應和有機物的分解。

圖3 空白組與除氮型改性凹凸棒土主要細菌門類分析Figure 3 Analysis of the main bacterial categories in the blank group and Al@TCAP-N

3.2 酶活性角度解析凈化機理

分析各個時段酶活性，可以發現，火山石內的酶活性整體高于Al@TCAP-N內的酶活性。原因可能是Al@TCAP-N固定微生物的能力較弱，火山石比較容易負載微生物[25-26，33]。該結果提示我們可通過Al@TCAP-N的吸附和火山石負載微生物的雙重作用降低水中有害物質的含量。本試驗檢測的幾種酶中，亞硝酸鹽還原酶NIR、硝酸鹽還原酶Nar和AMO參與氮的循環。其中，AMO是氨氧化反應的催化劑，能夠幫助氨氧化菌將NH3-N轉化為NO-2-N[9]；NIR可以將-N降解為N2或NH3-N[10]；Nar是一種誘導酶，可直接將-N還原為-N[11]。火山石和Al@TCAP-N中的Nar在12～24 h上升，凈化材料周圍水體中的Nar在24～36 h上升，說明添加凈化材料加快了反硝化作用。有部分時間點存在Al@TCAP-N中AMO、Nar和NIR酶活性高于火山石中AMO、Nar和NIR酶活性以及凈化材料周圍水體中AMO、Nar和NIR酶活性高于兩種凈化材料內部AMO、Nar和NIR酶活性的情況。這可能有以下原因：一是溶氧限制了硝化和反硝化作用，進而影響酶活性[9-11]；二是硝化細菌的生長過程較為緩慢[33]，且易受到其他異養菌的影響[34]；三是凈化后期凈化材料內部孔隙中微生物達到上限，凈化能力也隨之下降[35]。上述結果充分說明凈化材料加入后材料內部微生物富集加速了氮循環過程，但對水體中氮素的去除還受到水質指標、微生物群落中主要類群和材料特性所帶來吸附能力的影響。

而對于磷的分解，有機磷水解酶OPH和堿性磷酸酶AKP參與有機磷分解。其中，OPH可以分解有機磷化合物，減少有機磷對于環境的污染[12]；AKP能催化有機磷的分解并釋放正磷酸鹽，增加水中可溶性有效磷，便于吸收利用[13]。試驗結果顯示，0～6 h時，火山石和Al@TCAP-N中的AKP、AMO的活性有明顯升高，而在6～12 h階段，凈化材料周圍水體中的AKP、AMO活性才升高。這說明火山石和Al@TCAPN能同時促進有機磷的分解作用和亞硝化作用，研究表明在保證營養鹽去除效果的前提下，將凈化材料復合使用的添加量要小于單獨使用時的添加量[3]，提示兩種材料復配可以起到一定程度的協同效果，并能極大減少材料的使用量。脫氫酶DHO通過傳遞有機物上的氫進而分解有機物[14]。本結果表明Al@TCAP-N能在后期（36～48 h）增加DHO的活性，促進有機物的分解。

3.3 凈化材料在水質凈化中的應用

凈化材料的吸附和微生物菌落生長需要尋求最佳配合時間以便于吸附和生物降解協同進行。在0～36 h，TN、TP和CODMn的去除率上升，說明在微生物和凈化材料的作用下水質污染得到一定程度的緩解；在36～48 h，TN和TP的含量上升，說明隨著時間的推移，更多微生物充填于材料四周，使其吸附功能下降[35]。該結果提示，在養殖過程中，初沉單元水力停留時間應為36 h，雖然不能確保一些養殖品種在尾水集中排放階段營養鹽的去除效果，但可以明確的是外源微生物的引入能起到一定的營養鹽強化去除作用；冬季因植物生長緩慢、微生物代謝能力弱導致吸收能力降低的問題也無法得到解決，但可以篩選性能更好的鑭改性等礦物吸附材料，增加壩的數量，改變壩的流向，強化生態濕地凈化區的修復功能，實現吸附和生物凈化雙管齊下。

上述結果均表明外源微生物的加入能帶來水質修復相關細菌及酶活性的變化，結合本研究中的最佳水力停留時間36 h及水質修復相關細菌、真菌主要門類等特征，在實際運行過程中，可通過持續外源添加菌制劑和活性污泥強化凈化材料的水質修復效果。此外，為防止凈化材料在沉淀池中發生堵塞，可將凈化材料填充在網袋中延長水力停留時間和便于整體移出進行沖洗，沖洗后的水可經過凈化輸送到循環利用的生態蓄水池凈化區中進行藻類的培養。對使用后的材料對氮磷營養素的承載能力進行的研究結果表明，每克Al@TCAP-N約吸附201.73 μg氮和18.22 μg磷。每克火山石約吸附 59.54 μg氮和 34.98 μg磷[3]。這些材料經磨碎后具有一定的增加肥力和疏松土壤之功效，方便資源化利用。

4 結論

（1）Al@TCAP-N和火山石能促進水體中含磷化合物的分解和氮的轉化。火山石能在凈化初期（0～6 h）促進有機磷化合物分解和硝態氮（NO-3-N）轉化為亞硝態氮（NO-2-N）。Al@TCAP-N在凈化后期（36～48 h）促進有機物的分解。

（2）36 h通過Al@TCAP-N的吸附和火山石負載微生物的雙重作用對TN、TP、CODMn的去除效果最佳，去除率分別為22.61%、9.52%和22.16%。

（3）在實際應用過程中，36 h為最佳凈化時間，可通過Al@TCAP-N的吸附和火山石負載微生物的雙重作用降低水中營養鹽的含量。