微生物強化對石油污染土壤的修復特性研究

王娣，馬闖，高歡，劉恒，徐會寧，吳蔓莉

（西安建筑科技大學環境與市政工程學院，陜西省環境工程重點實驗室，西北水資源與環境生態教育部重點實驗室，西安 710055）

生物強化（Bioaugmentation）是指向污染環境中接種外源微生物以對污染物進行去除的方法[1-2]。由于接種的降解菌可對目標污染物進行直接降解，因此具有針對性強、對污染物去除速度快等優點，已成為廣為采用的石油污染土壤修復技術[3-6]。已有大量文獻研究對石油烴降解菌的篩選和鑒定進行了詳細報道。篩選出的可降解石油烴的菌屬包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、節桿菌屬（Arthrobacter）、產堿菌屬（Alcaligenes）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、紅球菌屬（Rhodococcus）和黃桿菌屬（Flavobacterium）等多種菌屬[7-12]。此外，對降解菌群的構建和外源菌群接種對石油烴去除效果的影響也有較為詳細的研究報道[13-15]。

生物強化中接種的降解菌生長和代謝活性受土壤濕度、土壤養分和pH等土壤環境條件的影響較大[16-17]。Pacwa-P?ociniczak等[18]向初始含油量為11 980 mg·kg-1的土壤中接種紅球菌屬進行生物強化修復，接種量為108cfu·g-1、保持土壤濕度為50%的田間持水量修復182 d時，石油烴去除率達到38.4%。Wu等[19]向黃土壤中接種由Pseudomonas stutzeri GQ-4 strain KF453954、Pseudomonas SZ-2 strain KF453956和Bacillus SQ-2 strain KF453961構成的降解菌群，接種量為108cfu·g-1、土壤濕度為20%修復8周，石油烴去除率達到58%。目前的研究工作多是對最佳濕度和接種量條件下的石油烴去除效果進行研究，但對于不同接種量的降解菌群在土壤自然濕度條件下的生長存活狀況研究相對較少。

本文利用富集培養法從石油污染土壤中篩選出石油烴降解菌群，在兩種不同土壤濕度條件下（5.4%和15.0%）向污染土壤中接種降解菌群進行生物強化修復處理，研究接種量和濕度對降解菌群生長和存活的影響以及對石油烴的去除效果，研究可為深入理解降解菌群接種生物強化修復提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 降解菌群的篩選

以采自陜北延長某油井周圍的石油污染土壤為石油烴降解菌菌源。土壤的基本理化性質為：pH 7.68、總氮1 170 mg·kg-1、有效磷15.92 mg·kg-1、銨態氮14.70 mg·kg-1、硝態氮0.38 mg·kg-1，土壤含油量為15 233 mg·kg-1。

富集篩選培養基——L9培養基：Na2HPO4·12H2O 17.689 g·L-1，KH2PO43.0 g·L-1，NH4Cl 1.0 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，1 mL·L-11 mol·L-1MgSO4，2.5 mL·L-1微量元素。微量元素組成：MnCl2·2H2O 23 mg·L-1，MnCl4·H2O 30 mg·L-1，H3BO331 mg·L-1，CoCl2·6H2O 36 mg·L-1，CuCl2·2H2O 10 mg·L-1，NiCl2·6H2O 20 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 30 mg·L-1，ZnCl250 mg·L-1。

富集篩選方法：稱取5.0 g石油污染土壤，無菌條件下加入50.0 mL滅菌的L9培養基，30℃、150 r·min-1條件下振蕩培養2 h以提取土壤中的總微生物。將提取物靜置30 min后，移取5 mL提取液轉接至含1%原油（取自長慶油田采油六廠）的100.0 mL L9培養基中，相同條件下連續培養7 d，如此轉接5次后，將最后一次獲得的培養液在10 000 r·min-1條件下離心分離獲得混合菌，利用PBS無機鹽緩沖液洗滌混合菌5次。將混菌懸液OD值調節為1.0，600 nm處測定，相當于1×108cfu·mL-1的菌量。獲得的混菌懸液用MC表示。利用高通量測序分析降解菌群MC的組成，并將獲得的菌群用于后續生物強化修復方案中。

1.2 生物強化修復方案

將石油污染土壤經碎散、除雜、過0.85 mm篩后混勻。稱取36份100.0 g的石油污染土壤分裝于36個燒杯中，具體修復方案見表1。表1中，CK、A、B、C、D、E為土壤自然濕度（5.4%）實驗組；CK’、A’、B’、C’、D’、E’為15.0%濕度實驗組（修復過程中定期向土壤中加滅菌純水，使土壤濕度為15%）。將1.1中獲得的降解菌懸液MC按表1設定的接種量分別接種于石油污染土壤中，CK和CK’為不進行接種處理的控制組。每個處理設置3個平行。

表1 石油污染土壤的修復方案設計Table 1 Experiment design for bioremediation of petroleum-polluted soil

所有樣品均放置在實驗室內，每隔3～4 d用滅菌玻棒翻動土壤以保證充氧量，在修復的第7、15、30、45、60 d時取樣測定土壤中總石油烴含量。

1.3 石油烴測定方法

采用超聲波萃取法提取土壤中的總石油烴并利用質量法進行測定[20]。詳細步驟為：準確稱取風干土樣3.000 g置于離心管中，加入正己烷和二氯甲烷1∶1混合萃取劑15.0 mL，利用超聲細胞破碎儀（SONICS，JY92-Ⅱ，美國）超聲萃取10 min（萃取功率為170 W），4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心15 min，利用定量濾紙過濾提取液于已稱質量的稱量瓶中，重復萃取3次。將稱量瓶放于通風櫥，使其中的提取劑揮發，待完全揮發至恒質量后稱取質量。

1.4 高通量測序分析

在修復第7 d和第60 d時，從接種量為108cfu·g-1、自然濕度的土壤（標號為E7、E60）和接種量為107cfu·g-1、濕度為15.0%的土壤（編號為D’7、D’60），以及修復60 d時的控制組土壤（編號為CK60、CK’60）的各3個重復樣品中，選擇石油烴測定結果最接近的2個平行樣品，送上海生工（https：∕∕www.sangon.com∕）進行高通量測序分析。

使用Prinseq軟件對高通量測序結果進行質量控制，將所測序列與RDP數據庫進行序列比對，使用Usearch軟件去嵌合后歸類為同種可操作分類單元（OTU），利用Mothur公式計算多樣性指數，利用RDP classifier對測序結果進行物種分類[21]。細菌門水平和屬水平的相對豐度計算方法見公式（1）：

式中：λ為第i種細菌門水平（屬水平）的相對豐度；Si為第i種細菌門水平（屬水平）的有效序列數；S為該土樣中微生物的總有效序列數。

1.5 數據處理

使用SPSS 19.0軟件對總石油烴去除率進行One-way-ANOVA方差分析，顯著性水平取0.05。采用Origin 9.0軟件作圖。

高通量測序結果顯示，每個處理的2個平行樣品測定結果的重復性較好，從中隨機選取1個樣品的測定結果進行后續分析。

2 結果與討論

2.1 石油烴降解菌群組成

利用富集培養方法從陜北地區石油污染土壤中篩選出以石油烴為唯一碳源和能源生長的菌群MC。經高通量測序從MC中獲得的有效序列數為94 919，OTUs數目為278個，歸屬于19個門。降解菌群主要由變形菌門（Proteobacteria，99.75%）組成，其余的幾種菌門包括放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的總豐度不高，為0.25%。降解菌群的優勢菌屬為不動桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）（圖1）。

不動桿菌屬和假單胞菌屬是文獻報道的常見石油烴降解菌[22-27]。本課題組在前期的研究中，利用Bush-hass培養基從陜北石油污染土壤中篩選出的降解菌組成均為假單胞菌屬和不動桿菌屬[28]。說明這兩種菌屬是陜北地區石油污染土壤中普遍存在的可降解石油烴的菌屬。

2.2 接種降解菌對土壤中石油烴去除效果的影響

圖1 石油烴降解菌群MC組成Figure 1 The compositions of petroleum-degrading flora MC

自然濕度（5.4%，圖2）條件下修復60 d，A、B、C、D、E土壤樣品中總石油烴含量分別從15 233 mg·kg-1降低至14 767、15 167、14 867、14 683 mg·kg-1及13 617 mg·kg-1，石油烴去除率分別為3.06%、0.44%、2.41%、3.61%、10.61%。不接菌的CK土壤中含油量降至14 422 mg·kg-1，總石油烴去除率為5.32%。自然濕度條件下，當降解菌群接種量為108cfu·g-1時，接入的降解菌群對土壤中石油烴起到一定的去除作用。接種量低于108cfu·g-1時的石油烴去除率低于CK組，可能是由于接種菌群數量少，沒有生長為優勢菌，接種后反而抑制了原有降解菌的生長和活性。

圖2 自然濕度（5.4%）條件下接種量對石油烴去除的影響Figure 2 The effects of MC inoculation amount on petroleum hydrocarbon removal under 5.4%natural moisture

15.0 %濕度條件下，A′、B′、C′、D′、E′處理中，總石油烴含量由15 233 mg·kg-1分別降低至12 867、13 400、14 200、12 389、12 511 mg·kg-1，石油烴去除率分別為15.54%、12.04%、6.78%、18.67%、17.87%。未接菌的CK’土壤中總石油烴含量降低至13 833 mg·kg-1，石油烴去除率為9.19%（圖3）。因此，當保持土壤濕度為15%時，除接種量為105cfu·g-1的土樣外，經過60 d的生物強化，土壤中總石油烴殘留量均低于CK’。接種量為105cfu·g-1時的石油烴去除率最低，可能是由于此時降解菌在土壤中雖然有一定的生長，但是沒有生長為優勢菌，而且此時的生長量抑制了土著降解菌的活性，因此使得石油烴去除率最低。

對不同濕度土壤中石油烴的去除效果進行比較分析，見圖4。土壤濕度為15.0%時對石油烴的去除效果總體上好于自然濕度下的修復處理。

濕度是影響微生物生長和活性的重要條件。水分過高或過低均可使土壤微生物活性降低[29]。一些研究結果表明，土壤濕度為12%～20%時，微生物活性最強，有利于對石油烴的降解。濕度過高會使土壤透氣性變差，影響降解菌對石油烴的代謝功能[30]。本文的研究結果表明，與自然濕度下接種相比，在保持土壤濕度15%條件下進行接種修復，對土壤微生物多樣性的影響較小，石油烴的去除率相對較高。因此，在對石油污染土壤進行生物強化修復時，適當的土壤含水率有利于石油烴的降解。

圖3 15.0%濕度條件下接種量對石油烴去除的影響Figure 3 The effects of MC inoculation amount on petroleum hydrocarbon removal under 15.0%moisture

圖4 不同濕度條件土壤修復60 d的總石油烴去除率Figure 4 TPH degradation efficiency under different humidity conditions at 60 d of bioremediation

本研究篩選出MC降解菌群在水相中對原油具有很好的降解性能，搖瓶實驗中，經過30 d的生物降解，MC菌群對水相中石油烴去除率達到89.28%，該結果未在本文中顯示。當向石油污染土壤中接種MC菌群進行強化修復處理時，土壤石油烴最高去除率僅為18.67%。

在以前的研究中，向黃土壤中接種其他降解菌群修復8周，石油烴去除率達到58%[19]；接種單一石油烴降解菌AcinetobacterSZ-1 strain KF453955修復10周，對土壤中石油烴的去除率為34%[20]。這些結果說明生物強化修復的石油烴去除效果可能受到多種因素的影響，外源菌與土著功能降解菌之間可能存在某種特殊的平衡交互作用。

2.3 降解菌群在不同接種條件下的生長及對土著菌群的影響作用

在修復的第7 d和第60 d，采集兩種濕度條件下對石油烴去除效果較好的土壤樣品（E和D’）和對照組（CK和CK’組）土壤樣品，進行高通量測序分析，研究降解菌群在不同濕度條件下的生長存活情況及其對土壤土著菌群的影響作用。

2.3.1 菌群的alpha多樣性

Ace和Chao1指數表征土壤微生物的豐富度，其值越大，土壤微生物的豐富度越大。Shannon指數和Simpson指數表征土壤菌群的均勻度，Shannon指數值越大，Simpson指數越小，土壤微生物的均勻度越高[31-32]。

表2為不同處理土壤的微生物多樣性測定結果。從土壤樣品E7、E60、D′7、D′60、CK60及CK′60中測得的有效序列數分別為76 434、67 486、68 120、72 392、64 923、73 632。自然濕度條件下向土壤中接種降解菌群進行修復7 d（E7）和60 d（E60）時，土壤的Shannon指數為3.66和3.09，Simpson指數為0.13和0.19，ACE指數為9 653.19和7 842.22，Chao1指數為7 187.33和5 597.03。Shannon指數、Chao1指數和ACE指數在所測土壤樣品中均最小，Simpson指數最大，說明在自然濕度條件下對污染土壤進行接種強化修復處理，可使土壤微生物群落多樣性明顯降低。

與CK′60相比，D′7和D′60土壤樣品的Shannon指數和ACE指數有所降低，但降低程度小于自然濕度條件下的接種處理。

本研究中，接種降解菌群進行生物強化修復使土壤微生物的均勻度和豐富度降低，與我們前期研究所得結果基本一致[21，33]。本研究結果表明，在提高土壤濕度的條件下進行接種修復，可以使土壤微生物多樣性保持較為穩定的狀態。

2.3.2 土壤微生物群落組成變化

2.3.2.1 降解菌在土壤中的生長情況和土壤中門水平微生物群落組成

圖5為MC菌群和土壤中12種主要菌門的相對豐度，其余菌門相對豐度合并為Others。土樣CK60、E7、E60、CK’60、D’7、D’60中的細菌門數量分別為28、28、23、28、26、26。CK60土壤中主要優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria，28.22%）、放線菌門（Actinobacteria，21.97%）、酸桿菌門（Acidobacteria，14.88%）、浮霉菌門（Planctomycetes，10.09%）。E7和E60土壤中，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度增加至66.35%和70.24%。放線菌門（Actinobacteria）相對豐度基本不變，酸桿菌門相對豐度降低為2.85%和2.94%。D’7和D’60土壤中變形菌門相對豐度增加為57.98%和50.22%，放線菌門相對豐度降低至17.96%和24.08%。

表2 石油烴降解菌群MC和不同修復處理的土壤微生物多樣性指數Table 2 Biodiversity index of petroleum-degrading microbial flora（MC）and soils with different treatments

圖5 MC菌群和不同處理土壤中優勢細菌門水平的相對豐度Figure 5 Relative abundance of the dominant phyla in the MC flora and different treated soils

降解菌群MC中變形菌門（Proteobacteria）相對豐度為99.75%。在兩種濕度條件下向土壤中接種MC 7 d時，土壤中變形菌門相對豐度明顯增加（圖5），說明在不同濕度下接種的降解菌群可在土壤中快速生長，并在較長時間內（60 d）仍然保持存活狀態。

2.3.2.2 屬水平微生物群落組成結構分析

圖6為MC菌群和土壤中前20種優勢菌屬的相對豐度，其余菌屬相對豐度合并為Others。降解菌群MC主要由不動桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）組成。CK60土壤中的優勢菌屬包括Gp6（5.49%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，4.18%）、Gaiella（3.44%）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas，2.32%）。

圖6 MC菌群和不同處理土壤中優勢細菌屬水平的相對豐度Figure 6 Relative abundance of the most abundant genera in the MC flora and soils with different treatments

在自然濕度（5.4%）條件下接種MC菌群修復7 d時，假單胞菌屬（Pseudomonas，30.87%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，25.86%）和諾卡氏菌屬（Nocardia，13.27%）成為土壤中的優勢菌屬。修復60 d后，這3種菌屬仍為優勢菌。其中，不動桿菌屬（Acinetobacter）相對豐度增加至35.74%，假單胞菌屬（Pseudomonas）和諾卡氏菌屬（Nocardia）相對豐度基本保持不變。

在土壤濕度為15.0%條件下接種MC菌群修復7 d時，不動桿菌屬（Acinetobacter，30.25%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，5.03%）成為優勢菌屬。修復60 d時，不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）仍為土壤中的優勢菌屬，但與修復7 d時相比，相對豐度降低。

降解菌群MC主要由不動桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）組成。在自然濕度和15.0%濕度條件下接種石油烴降解菌群修復7 d，不動桿菌屬和假單胞菌屬成為土壤中的優勢菌屬。說明接種的降解菌可在土壤中迅速生長，且其生長不受土壤濕度的影響。假單胞菌屬在自然濕度土壤中的相對豐度較大，說明假單胞菌屬適宜在濕度較低的土壤中生長。

3 結論

（1）從陜北延長某地區石油污染黃土壤中篩選出的石油烴降解菌門主要為變形菌門（Proteobacteria，99.75%），主要菌屬為不動桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）。

（2）自然濕度條件下（土壤濕度為5.4%）降解菌群接種量為108cfu·g-1，15.0%濕度條件下降解菌接種量為107cfu·g-1時，修復60 d的土壤中石油烴去除率分別為10.61%和18.67%，對總石油烴的去除率高于未接種降解菌的控制組（石油烴去除率為5.32%和9.19%），15.0%濕度條件下對石油烴的去除效果好于自然濕度條件下的生物強化修復處理。

（3）不同濕度條件下接種7 d時，降解菌在土壤中生長并成為優勢菌。自然濕度條件有利于假單胞菌屬（Pseudomonas）的生長。接種60 d時，降解菌在土壤中仍然大量存活。接種降解菌群使土壤微生物多樣性降低，在15.0%濕度條件下接種有利于維持土壤微生物多樣性不發生明顯變化。