鈍化材料對農田土壤Cd形態及微生物群落的影響

蘭玉書，袁林，楊剛，程蓉，石梏岐，高本汗

（1.四川農業大學環境學院，成都 611130；2.四川省生態環境科學研究院，成都 610041；3.四川農業大學生態環境研究所，成都611130；4.中國地質科學院礦產綜合利用研究所，成都 610041）

土壤作為人類的生存之本，不僅是農業生產最基本的生產資料，同時也是生態系統各種環境污染物主要的源和匯[1-2]。據《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國耕地土壤點位超標率達19.40%，重金屬污染尤為突出。鎘（Cd）是常見的重金屬污染物之一，具有遷移能力強、毒性大、易被植物吸收等特點，過量的Cd會抑制農作物生長發育，降低產量，進入食物鏈后，對生物體造成極大的威脅[3-4]。因此如何利用輕度Cd污染土壤安全生產農作物成為研究的關鍵。固化修復技術通過向污染土壤中添加鈍化劑從而降低重金屬的流動性和生物可給性，具有破壞性小、成本低且安全的特點[5-6]。石灰、海泡石作為目前運用較為廣泛的鈍化劑，對降低土壤重金屬有效性有良好的效果[7-8]。研究表明，污染農田中施用石灰可明顯降低水稻秸稈和谷物及蔬菜中重金屬的積累[9-10]。袁興超等[11]運用海泡石（45 t·hm-2）鈍化處理鉛鋅礦區周邊Cd、Pb污染農田，Cd鈍化效率可達36.5%。此外生物炭以環境友好且經濟性高的優勢而被推廣，相關研究表明生物炭不僅能為土壤增加養分，其疏松多孔的結構，還能對重金屬產生強大的吸附作用[12-13]。大田試驗研究顯示施加鈣基改性生物炭，土壤中有效態Cd的降幅達12.00%～30.20%[14]。另有研究表明葉面噴施適量微量元素肥料能夠提高植物營養，促進植物生長并降低重金屬對植物的危害[15]。金華等[16]研究表明納米螯合鐵肥在重金屬Cd污染農田治理中有良好的潛力，能夠有效降低植物對Cd的吸收。

目前，大多數的研究集中于鈍化劑對土壤重金屬形態的影響以及重金屬在植物中的遷移情況，而土壤中的微生物群落作為土壤重要組成部分比植物更具敏感性，被認為是衡量土壤生態功能的重要指標，研究表明施加鈍化劑會導致微生物群落功能響應發生變化[17]。楊勝香等[18]發現在鉛鋅尾礦廢棄地土壤添加不同碳氮磷源改良劑對土壤微生物群落組成、多樣性、微生物活性和微生物生物量均有顯著性影響。Xu等[19]研究發現，生物炭的加入增加了土壤中微生物生物量，改變了土壤的微生物群落結構。

對此，本研究在輕度Cd污染土壤農田中開展原位鈍化試驗，探討4種廣泛運用的鈍化材料（海泡石、石灰、生物炭及螯合鐵肥）對土壤Cd形態、生態風險及微生物群落的影響，以期進一步為鈍化修復輕度Cd污染農田土壤提供理論支持和實踐經驗。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本情況

試驗田位于四川省攀枝花某農田（101°24′30.51″E，26°59′8.24″N），土壤類型以滲育型水稻土為主，土壤基本理化性質見表1。與《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）標準值相比，該農田土壤屬于輕度Cd污染。

1.2 供試材料

供試鈍化劑：海泡石（HP）、石灰（SH）、秸稈生物炭（SW）和螯合鐵肥（TF），均購于國藥集團化學試劑有限公司。各材料中Cd含量分別為0.25、0.08、0.33 mg·kg-1和0.03 mg·kg-1。

供試水稻品種為超級雜交水稻德優4727（DY），由四川省農業科學院提供。

1.3 試驗設計

試驗于2017年4—11月開展，試驗設置如下：CK處理為不添加任何鈍化劑；HP處理為添加海泡石1.12 kg·m-2；SH處理為添加石灰0.15 kg·m-2；SW處理為添加秸稈生物炭1.12 kg·m-2；TF處理為添加0.2%螯合鐵肥。每個處理設置3個重復，隨機排列，共設計15個小區（3 m×9 m）。其中，HP、SH處理和SW處理為水稻幼苗移栽前人工撒施鈍化材料，TF處理為水稻灌漿期，分兩次噴施于水稻葉面。

2017年4月開始在未受污染的土壤中進行水稻育苗，水稻幼苗移栽前5 d，將HP、SH處理和SW處理試驗小區所需的海泡石、石灰和生物炭采用人工撒施方法均勻施入對應小區，翻耕混勻（深度20 cm）并平整土地。水稻育苗完成，采集并選取長勢一致、健康的水稻幼苗進行移栽，水分管理與傳統種植方式一致。TF處理組在水稻進入灌漿期后，分兩次將0.2%螯合鐵肥噴施于水稻葉面。2017年9月上旬收獲水稻并采集樣品。

1.4 樣品采集及測定

土壤樣品于水稻成熟期采集，在各試驗小區采集至少5個點的0～20 cm層土壤，混勻，挑出植物殘體和石塊后，采用四分法裝袋。一部分新鮮土樣裝于封口袋放于冷凍箱儲存，用于分析微生物相關指標；另一部分樣品儲存于自封袋內并轉移至實驗室通風處進行自然風干，磨細，過篩后分別裝袋，標記待用。

表1 土壤基本理化性質Table 1 Physical and chemical properties of the experimental soil

土壤pH采用電位法測定[20]；土壤基本理化性質參考《土壤農化分析》測定[20]；土壤重金屬形態分級采用BCR連續提取法提取[21]，ICP-MS測定；重金屬Cd全量采用HNO3-HF-HClO4消解，ICP-OES測定，以GBW07428（GSS-14）作為質控，該土壤標樣為四川盆地土壤，Cd定值為0.20±0.02 mg·kg-1，試驗測量值為0.18 mg·kg-1。

土壤微生物測定：樣品按照DNA試劑提取樣品基因組DNA，進行PCR擴增，基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序（Paired-End）的方法，構建小片段文庫進行測序。

1.5 土壤污染評價方法

生態風險系數是綜合反映重金屬對生態環境影響潛力的指標[22]。潛在生態危害程度分級標準見表2。

式中：Cf為污染系數；F1為可交換態Cd含量，mg·kg-1；F2為可還原態Cd含量，mg·kg-1；F3為可氧化態Cd含量，mg·kg-1；F4為殘渣態Cd含量，mg·kg-1；Er為單一重金屬潛在生態風險指數；Tr為重金屬的毒性因子，Cd的Tr取值為30[23]。

表2 潛在生態危害指數Er標準Table 2 Standard for grading of potential ecological risk index

2 結果與分析

2.1 鈍化劑對土壤理化性質的影響

處理組pH值與對照組相比均有所增加，其中HP和SW處理組顯著升高，分別增加1.29、0.44個單位。處理組pH值由大到小依次為HP＞SW＞SH＞TF（表3）。土壤有機質及N、P、K含量是衡量土壤肥力的重要指標，研究結果顯示，HP處理組有機質含量顯著增加37.15%，其余處理組變化未達到顯著水平；SW處理組速效K顯著增加，與對照組相比含量增加103.92%；HP與SH處理組速效P含量分別顯著降低29.54%、40.85%，其余處理組變化不顯著。

2.2 土壤Cd形態及生態風險變化

鈍化劑對土壤重金屬Cd含量及Cd形態的影響如圖1所示。與對照組相比，SH處理組土壤中的Cd含量下降3.09%，HP、SW和TF處理組均有所增大，分別增加5.95%、3.77%、4.03%，但Cd含量變化并未達顯著水平。

對照組中重金屬Cd的可還原態占比最多（0.35 mg·kg-1，43.33%），其次是可交換態（0.31 mg·kg-1，39.28%）、殘渣態（0.11 mg·kg-1，13.28%）及可氧化態（0.03 mg·kg-1，4.11%）。鈍化處理后各組土壤中Cd的可交換態與對照組相比降低了29.79%～64.48%，降幅比例由大到小依次為 HP＞SW＞SH＞TF。SH、HP、SW、TF處理組與對照組相比，可氧化態含量分別增加79.86%、57.87%、62.50%、159.72%，殘渣態含量分別增加57.82%、171.83%、101.79%、86.11%。

土壤中潛在生態風險系數（Er）揭示了土壤中Cd的危害程度，結果如表4所示。對照組Cd的Er值為195.84，表明具有高潛在生態風險。其余處理組與對照組相比，Er值均降低，SH、SW、TF處理組Cd的Er值介于80～160，由高潛在生態風險降為較高潛在生態風險。HP處理組Cd的Er值為58.02，為中度潛在生態風險（表4）。鈍化劑的施用顯著降低了土壤Cd的生態風險。

表3 鈍化處理對土壤理化性質的影響Table 3 Physical and chemical properties of the soils of different treatments

圖1 鈍化處理對土壤Cd總量及賦存形態的影響Figure 1 Effects of different passivators on total Cd and Cd fractions in paddy soil

2.3 鈍化劑對土壤微生物群落多樣性的影響

不同鈍化處理下土壤微生物的OTUs數和群落多樣性指數的變化情況見表5。各處理高通量測序覆蓋率均大于99%，反映本次測序結果樣本中物種被檢測出的覆蓋率高。總體來看，施加鈍化劑增加了HP、SH和SW處理組群落的多樣性，但TF處理組的OTUs數及群落多樣性指數均出現下降。從微生物群落豐富度來看，TF處理組的ACE和Chao1指數分別降低2.26%、2.07%，其余各組均有所增加，從大到小依次為SH＞SW＞HP。從微生物群落多樣性來看，TF處理組的Shannon指數下降5.50%，其余各組均有所增加。Shannon指數增幅最大的為SW處理組，其次為SH處理組。

表4 土壤重金屬Cd生態風險評價Table 4 Ecological risk assessment of Cd in soil

土壤細菌門的相對豐度結果顯示：優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和綠彎菌門（Chloroflexi），相對豐度占比68.56%～77.60%（圖2）。在所有處理中，變形菌門占比最高，為31.53%～39.83%。其次為酸桿菌門和放線菌門，分別占比13.18%～18.26%和10.35%～14.34%。所有土壤中均發現芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠菌門（Chlorobi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae），但相對豐度較低。施加鈍化劑后，各處理組變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門豐度均增加，芽單胞菌門、綠彎菌門、螺旋體菌門相對豐度均降低。HP處理組的酸桿菌門和放線菌門相對豐度降低，其余各組增加。

基于Beta多樣性分析，使用R語言工具繪制的PCoA分析結果見圖3，第一主成分（PC1）對樣品差異的貢獻值為50.73%；第二主成分（PC2）對樣品差異的貢獻值為29.13%，表明土壤微生物群落結構組成受到不同鈍化處理的影響較大。其中SW、HP和SH組距離較近，說明此3個處理組微生物群落結構較為相近，而距離較遠的對照組及TF處理組微生物群落結構差異較大。通過物種豐度聚類熱圖（圖4）可知，SW與HP聚在一起，這兩者又與SH聚類在一起，TF相距最遠，該結果證實了上述PCoA的分析結果，且由圖呈現結果可以看出不同鈍化劑的施用使某些微生物群落得到抑制或增強。

表5 不同處理土壤微生物群落功能多樣性指數的變化Table 5 Changes in the functional diversity indices of the soil bacterial communities in the different treatments

圖2 鈍化劑對水稻根際細菌門水平平均相對豐度的影響Figure 2 Effects of different amendments on the main phyla average relative abundance of rice rhizosphere bacteria

圖3 不同處理微生物群落PCoA分析Figure 3 Principal coordinates analysis（PCoA）of bacterial communities in the soils from different treatments

圖4 不同鈍化處理細菌門水平物種豐度聚類熱圖Figure 4 Heat maps of different amendments on the main phyla abundance of bacteria

土壤微生物群落多樣性與理化性質相關性分析結果如表6所示，pH與OTUS、ACE和Chao1指數顯著正相關，與Shannon呈正相關；有機質、堿解N、速效P及速效K與微生物群落多樣性指標均無顯著性相關，且相關性較低；Cd與ACE和Chao1指數顯著正相關，與OTUS及Shannon呈正相關，但生態風險系數（Er）與各微生物群落多樣性指標均呈負相關關系。進一步分析各樣品及微生物群落與不同形態Cd之間的關系（圖5），RDA分析結果顯示，各Cd形態之間的關系表現為殘渣態分別與可還原態和可氧化態呈正相關，而可交換態與其余3種形態均為負相關，尤其與殘渣態呈顯著負相關。土壤細菌門與Cd形態的關系為擬桿菌門和變形菌門與可交換態呈顯著負相關，芽單胞菌門、螺旋體菌門和放線菌門與可交換態呈正相關。

表6 土壤微生物群落多樣性與土壤理化性質相關性分析Table 6 Correlation analysis between soil bacterial ecological diversity and soil physical and chemical properties

圖5 不同處理微生物群落組成的冗余分析Figure 5 Redundancy analysis of bacterial community composition in different treatments

3 討論

3.1 鈍化劑對土壤理化性質和Cd形態的影響

使用堿性改良劑原位修復重金屬酸性污染土壤是一種成熟且有效的方法[24]。鈍化劑的施加一定程度上改變了土壤理化性質，尤其顯著提高了土壤pH，且施加生物炭具有增強土壤肥力的優勢。研究結果顯示，施加鈍化劑后土壤重金屬Cd略有增加，但未達到顯著水平。推測一方面是由于施加的鈍化劑含有重金屬Cd（0.03～0.33 mg·kg-1），另一方面由于大氣沉積致使重金屬Cd不斷進入土壤。此外，由于不同處理中地表徑流和浸出率不同，導致土壤中Cd累積量有所不同[25]。因此實際運用中選用鈍化材料不僅需要考慮經濟性、鈍化效果，同時還需兼顧其對生態環境的潛在風險。

土壤中Cd總量并不能反應生態風險的影響，分析土壤中Cd不同形態具有重要意義。土壤中的可交換態Cd易被植物直接吸收，可還原態和可氧化態Cd在一定條件下能轉變為可交換態，能夠間接被植物吸收[26-27]。研究顯示，施用鈍化劑使得可交換態Cd向可氧化態和殘渣態轉化，其含量顯著降低。土壤pH值對重金屬形態有顯著影響，提高土壤pH能夠降低土壤重金屬的有效性和遷移能力，其原因是pH影響著土壤重金屬的溶解-沉淀平衡[28-29]。研究結果顯示HP處理組土壤Cd的可交換態降幅最大，為64.48%。由于海泡石具有比表面積大、吸附性強的特點，能有效吸附土壤重金屬[30]。曹雪瑩[31]研究表明，向Cd污染酸性紅壤中施加0.5%的海泡石使土壤Cd有效態濃度降低了53.10%，這與本研究結果一致。SW處理組土壤Cd的可交換態下降33.71%。生物炭同樣具有比表面積大的特點，此外，其表面含有大量官能團可與土壤中重金屬絡合而顯著降低重金屬生物有效性[32]。

3.2 鈍化劑對土壤微生物群落及多樣性的影響

不同鈍化劑對土壤微生物群落產生不同的影響，這可能是由于鈍化劑能夠抑制或增強特定的微生物群落。TF處理組中土壤微生物群落的多樣性和豐度均降低，說明螯合鐵肥不利于微生物群落的生長。SW處理組的土壤微生物多樣性在各處理中最高，但豐度較差。已有研究表明，生物炭的應用提高了微生物的養分利用率，從而使微生物的豐度和活性得到提高[33]。SH處理組微生物群落豐度均有所提高且ACE和Chao1指數均最大。

在細菌群落組成上最豐富的是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線 菌門（Actinobacteria）和 綠 彎菌 門（Chloroflexi）。這與其他研究結果類似，這些菌群常出現于重金屬污染土壤，屬于核心菌群，表明這些細菌群可能為耐金屬的生物體[34-35]。研究結果顯示，土壤中的變形桿菌門相對豐度最大，施加鈍化劑后增加0.75%～23.69%。許多研究報道變形桿菌門對重金屬污染不敏感，能夠在重金屬濃度較高的環境中生存[36-37]。一般認為，酸桿菌門嗜酸，不利于在堿性環境中生存[38-39]。而本研究結果顯示，添加鈍化劑后土壤pH值增加，酸桿菌門相對豐度也有所增加，與該結論矛盾。但也有研究發現在中性、堿性的環境中檢測出酸桿菌的基因序列，并表示酸桿菌門的相對豐度與土壤中多種環境因子相關[40-41]。推測該現象可能與酸桿菌對土壤環境因子響應存在差異有關[42]。此外，土壤中的厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度在施加鈍化劑后有所增加，厚壁菌門主要存在于適當的環境中[43]。因此，隨著重金屬Cd生態風險的降低，厚壁菌門相對豐度在增加。

大量研究表明，土壤微生物受多種環境因素影響，這些因素包括土壤理化性質、土壤酶活性、重金屬等[18，34，44]。本研究結果顯示，pH 與微生物群落功能多樣性指數顯著相關，說明該因素對微生物群落影響較大，而土壤營養物質對微生物群落的影響并不明顯。在多個研究中均得出pH是影響微生物群落的關鍵因素，主要由于pH能夠影響多種環境因素，包括土壤重金屬形態、營養物質及酶活性[45-47]。也有研究表明有機質是微生物的主要能量和營養來源，與微生物之間存在顯著的相關性[47-48]。但在本研究中并未得到此結論，推測該現象是由于土壤中有機質含量相對較低，因此可在農業種植過程中適當補充營養物質，更有利于土壤微生物的生長發育。此外Cd含量是影響微生物群落的另一要素，Xiao等[47]的研究中指出在重金屬污染的地區，微生物對金屬脅迫產生了耐受性，從而導致了微生物多樣性的增加[48-49]。微生物長期在Cd污染的土壤中對污染土壤逐漸適應，耐性微生物逐漸增多，所以在一定濃度的污染范圍內Cd與微生物豐度及多樣性出現了正相關關系。在相關性分析中發現Cd的生態風險指數（Er）與微生物群落多樣性指數負相關，說明微生物群落多樣性受Cd形態的影響。通過RDA分析結果得知Cd不同形態對優勢菌門影響有所不同，當重金屬形態產生變化會導致微生物群落結構發生變化。

4 結論

（1）與對照組相比，施加鈍化劑使土壤pH增加0.17～1.29，土壤中可交換態Cd降低29.79%～64.48%，土壤中的Cd由可交換態向可氧化態和殘渣態轉化。施加鈍化劑能降低土壤中重金屬Cd的生態風險。

（2）施加海泡石、石灰、秸稈生物炭土壤微生物多樣性和豐度均有所增加，但螯合鐵肥降低了土壤微生物OTUs數、微生物多樣性和豐度，不利于微生物群落的生長。

（3）施加不同鈍化劑改變了土壤微生物群落組成，各處理組變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）豐度均增加，而綠彎菌門（Chloroflexi）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對豐度均降低，pH和Cd是影響微生物群落的關鍵因素。