概述基因工程中的工具酶

張淑萍

摘要催化特異性反應的工具酶在基因工程中發揮著重要的作用，根據其催化反應特性可分為限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶和末端修飾酶4種類型。對這四種工具酶的發現和作用機制進行概述，并展望工具酶的應用前景。

關鍵詞 限制酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 末端修飾酶

中圖分類號Q-49文獻標志碼E

20世紀70年代，Paul Berg等人用限制性核酸內切酶（簡稱限制酶）將大腸桿菌（E.coli）的DNA切開后與病毒DNA連接，從而獲得了第一個重組DNA分子，實現了化學水平上DNA分子的重新組合。雖然這并沒有實現其遺傳和增殖的生物學意義，但在這一思想的指導下，Cohen和Boyer于1973年開展了具有劃時代意義的基因重組實驗，為基因工程的誕生與發展奠定了重要基石。

基因工程從狹義上講是指將載體與一種或多種生物體（供體）的基因在體外進行拼接重組，然后導入另一種生物體（受體）內，從而按照人們的意愿改變并表達出新的性狀。從廣義上講，基因工程是指基因操作原理和基因工程應用兩部分，包括上游技術（即狹義的基因工程）和下游技術（即大規模培養重組外源基因的生物細胞以及分離純化外源基因表達產物）。在基因操作過程中催化特異性反應的工具酶發揮著重要作用，根據其催化反應特性可分為限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶和末端修飾酶4種類型。

1限制酶

1.1限制酶的發現

早在20世紀50年代初，科學家發現兩種不同來源的λK和λB噬菌體分別可以高頻感染它們各自的大腸桿菌K株和B株宿主細胞，當它們各自與其他宿主菌交叉混合培養時，感染頻率會下降數千倍。λK噬菌體成功感染B株后，由B株繁殖出的λK后代在第二輪接種中便能像λB一樣高頻感染B株，但卻不再有效地感染它原來的宿主K株。10年后，人們搞清了這個過程的分子機制。在1968年，人們采用分步純化細胞提取物技術首次從E.coli中分離得到了限制酶。目前發現，限制酶廣泛存在于原核生物中，在細菌中已發現1 200余種。

1.2限制酶的作用機制

根據限制酶的結構與作用方式，可將其分為Ⅰ類限制酶（TypeⅠ）、Ⅱ類限制酶（TypeⅡ）和Ⅲ類限制酶（TypeⅢ）3種類型。其中，Ⅱ類限制酶識別切割位點比較專一，且不具有甲基化酶的活性，在DNA重組中被廣泛應用。而Ⅰ類和Ⅲ類限制酶由于在酶分子中包含限制性核酸內切活性和甲基化活性，因此被稱為限制/修飾酶，具體見表1。

2DNA連接酶

2.1DNA連接酶的發現

1967年，三個實驗室同時在大腸桿菌中發現了DNA連接酶，它連接DNA鏈上的5′-磷酸基團與另一DNA鏈的3′-羥基，生成磷酸二酯鍵，進而封閉缺口，在DNA的復制、重組和修復過程中發揮著重要的作用。根據催化過程中所需的能量來源可分為三磷酸腺苷（ATP）依賴型和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴型。迄今為止，DNA連接酶在病毒、細菌和真核生物體內均被發現，但NAD+依賴型未在真核生物中發現。

2.2DNA連接酶的作用機制

2.2.1ATP依賴型

一般動物細胞和噬菌體的DNA連接酶以ATP作為能量來源，可連接黏性末端和平末端，其作用機制分為三步：

①DNA連接酶在ATP和輔助因子Mg2+的作用下，形成酶-ATP復合物，ATP+DNA連接酶→酶-ATP+PPi。

②酶-ATP復合物上的AMP轉移到DNA的5′-磷酸基團，釋放出酶使其活化。

③活化的5′-磷酸基團與另一DNA鏈的3′-羥基生成磷酸二酯鍵，并釋放出一磷酸腺苷（AMP），封閉缺口。

2.2.2NAD+依賴型

與ATP依賴型相比，只是第一步不同，NAD+依賴型的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，如大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶。與ATP依賴型相比，其參與的反應只是第一步不同，具體反應如下：

NAD++DNA連接酶→酶-ATP+NMN。

3DNA聚合酶

3.1DNA聚合酶Ⅰ

3.1.1DNA聚合酶Ⅰ的發現

1957年，美國科學家阿瑟·科恩伯格等人最先在大腸桿菌中發現了DNA聚合酶，并將其命名為DNA聚合酶I，其分子量為109 kD，是由約930個氨基酸組成的單肽鏈。

3.1.2DNA聚合酶Ⅰ的作用機制

DNA聚合酶I不參與復制延長過程，但在合成岡崎片段的過程中發揮著重要作用，可催化延長約20個核苷酸的DNA。同時校讀復制中的錯誤，填補復制和修復中出現的空隙，具體過程如下：

①DNA聚合酶活性：以DNA單鏈為模板，在4種脫氧核糖核苷酸和引物存在下，使DNA鏈沿5′→3′方向延長；②3′→5′核酸外切酶活性：沿3′→5′方向識別和切除DNA復制過程中錯配的堿基，起到校對作用，從而保證DNA復制的正確性；④5′→3′核酸外切酶活性：從5′端降解雙鏈DNA或RNA，用于切除引物；⑤焦磷酸解作用：催化3′末端DNA分子發生焦磷酸解作用；⑥焦磷酸基交換：催化脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）末端的焦磷酸基和無機焦磷酸（PPi）交換。

3.2DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）

3.2.1DNA聚合酶Ⅰ大片段的發現

1970年，漢斯·克列諾于用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ時，原來的酶分子被切成76 kD和34 kD兩個片段，其中大片段通常稱為Klenow片段。它是由400個氨基酸形成α螺旋構型，其分子量是760 kD。

3.2.2DNA聚合酶Ⅰ大片段的作用機制

Klenow片段保持了DNA聚合酶Ⅰ中的DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性，但沒有5′→3′核酸外切酶活性。

3.3Taq DNA聚合酶

3.3.1Taq DNA聚合酶的發現

1988年，Saiki等人從溫泉中的水生噬熱桿菌分離提取獲得Taq DNA聚合酶，是第一個被發現的熱穩定DNA聚合酶，其最適反應溫度高達75～80℃，分子量為65kD。

3.3.2Taq DNA聚合酶的作用機制

Taq DNA聚合酶自一種耐熱菌提取，廣泛應用于PCR技術中，它具有5′→3′聚合作用（以DNA雙鏈為模板，結合特定的引物后，以四種脫氧核苷酸為原料按照堿基互補配對的方式從5′→3′方向合成新的DNA鏈）和5′→3′核酸外切酶活性，但不具有3′→5′核酸外切酶活性。

3.4逆轉錄酶

3.4.1逆轉錄酶的發現

1970年，Temin H M等人在致癌RNA病毒中發現了逆轉錄酶（也稱反轉錄酶），它是一種依賴RNA的DNA聚合酶。目前，科學家發現其也存在于其他細胞中，如煙草、蛙卵、哺乳動物分裂中的淋巴細胞和胚胎細胞等。

3.4.2逆轉錄酶的作用機制

逆轉錄酶是一種具有RNA指導下的DNA聚合酶活力、DNA指導下的DNA聚合酶活力和核糖核酸酶H（RNase H）活力的多功能酶，具體如下：

①RNA指導下的DNA聚合酶活力：催化以RNA為模板，在引物tRNA（主要是色氨酸tRNA）的3′-末端以5′→3′方向以dNTP為原料，聚合形成DNA的過程。由于其不具有3′→5′外切酶活性，因此無校正功能，催化合成的DNA具有較高的出錯率；②DNA指導下的DNA聚合酶活力：催化以逆轉錄合成的第一條單鏈DNA為模板，以dNTP為原料，再合成第二條DNA分子的過程；③RNase H活力：在逆轉錄酶作用下合成的cDNA與模板RNA形成DNA-RNA雜合鏈，再發揮其RNase H活力水解掉RNA分子的5′端。

3.5末端轉移酶

3.5.1末端轉移酶的發現

1958年，Bollum等從小牛胸腺中純化出末端轉移酶，此后在煙草培養的細胞、骨髓中的前淋巴細胞及分化早期的類淋巴細胞中提取出了末端轉移酶，其分子量為58.3 kDa，在輔因子Mg2+、Mn2+、Co2+等作用下，可加速其催化速率。

3.5.2末端轉移酶的作用機制

和大多數的DNA聚合酶不同，末端轉移酶是一種不需要模板的DNA聚合酶，其催化底物是帶有突出、凹陷或平投3′-游離羥基末端的單雙鏈DNA分子。末端轉移酶在突出末端時，被Mg2+激活后，兩條鏈的3′-端可以隨機聚合脫氧核苷酸，而在平頭或凹陷末端，被輔因子激活后，不按模板要求進行聚合反應。其反應過程需要的引物至少含有3個堿基短序列，可延長5～300 nt的長度。

4末端修飾酶

末端修飾酶包括多聚核苷酸激酶、堿基磷酸酶和S1核酸酶等，具體情況詳見表2。

目前，基因工程改善著人們的生活，為醫療、農業、工業等領域創造了巨大的價值。在基因工程中工具酶扮演著關鍵角色，其制備、性質研究和市場買賣已經形成了一個巨大產業。在基因工程的實際操作中使用的酶遠不止以上常用的工具酶。隨著生物科學技術的發展，未來在基因操作中還會有新的酶不斷參與進來并發揮重要作用。

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