結直腸癌患者血漿代謝物水平研究*

史祚秀，馮杰，劉洋，李碩，喬世峰

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院 普外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫科大學附屬第三醫院 病理科，遼寧 錦州 121000；3.山東大學齊魯醫院 ICU，山東 濟南 250000）

結直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內其發病率位居第4 位，死亡率居第3 位[1]。早期結直腸癌的5年生存率約達90%，晚期則不到10%。因此，結直腸癌的早期診斷顯得尤為重要[2]。結腸鏡作為結直腸癌診斷的金標準，難以用于普通人群的篩選，且易受腸道準備及醫生操作經驗的影響。

代謝組學是近年來用于定量分析氨基酸、脂肪酸、核酸及糖類等小分子物質的新技術。隨著對惡性腫瘤的深入研究，發現氨基酸、脂肪酸及糖類等可能在惡性腫瘤早期就已出現變化[3]。研究還顯示，氨基酸代謝物的變化與惡性腫瘤的關系更為密切[4]。

本研究擬分析結直腸癌患者手術前后血漿氨基酸及肉堿代謝物水平的差異，探究結直腸癌患者血漿氨基酸代謝物及肉堿中有無可作為結直腸癌診斷的生物標志物，并為腫瘤代謝治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2019年8月在錦州醫科大學附屬第一醫院普通外科住院的166例患者血液樣本，將其分為實驗組120例和對照組46例。實驗組男性62例，女性58例；年齡32 ～89 歲，平均（65.29±10.40）歲。對照組男性21例，女性25例；年齡36 ～88 歲，平均（63.13±12.45）歲。結直腸癌臨床分期依據美國癌癥聯合委員會第八版結直腸癌分期標準[5]。納入標準：①病理檢查明確診斷為結直腸癌；②年齡18 ～90 歲；③手術前未接受其他抗腫瘤治療；④常規實驗室檢查未見異常；⑤常規影像學檢查未見異常；⑥入院后經病理診斷為結直腸息肉或者腺瘤或者伴有消化道出血。排除標準：①其他部位腫瘤；②采用放化療或靶向治療；③嚴重代謝系統疾病；④血液系統疾病。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。兩組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器美國AB SCIEX 公司API 3200MD 質譜分析儀，日本島津株式會社LC20A 液相色譜儀，系統控制和數據收集采用美國AB SCIEX 公司分析軟件v1.6.0，數據預處理采用儀器自帶的Chemo views 軟件，配備的離子源是正離子電噴霧離子源（ESI+）。

1.2.2 試劑美國Thermo Fisher 公司乙腈和高純度的水，美國Sigma-Aldrich 公司正丁醇和乙酰氯，甲醇（商業購買），12 種氨基酸同位素內標（NSK-A）和8 個肉堿內標（NSK-B）購自美國Cambridge Isotope實驗室，質量控制（quality control, QC）標準品購自德國Chromsystems 公司。

1.2.3 樣本收集所有受試者于晨起空腹條件下采用干血滴濾紙片法（DBS）針刺指尖采集血樣，所有DBS 血樣保存于4℃及時送檢。

1.2.4 樣本處理用打孔器將送檢的DBS 濾紙片切割為直徑3 mm 的紙盤（相當于3.2μl 全血），然后將其置于96 孔過濾板中，每孔加入含內標的無水甲醇，置于孔板震蕩器室溫下震蕩20 min。用孔板離心機以1 500 r/min 離心2 min，將上層樣板中的提取液通過濾過膜過濾并收集于下層樣板中。每個樣板隨機選取4 個空白孔，分別添加2 個低水平和2 個高水平的QC 溶液，將上述濾出液和QC 溶液在氮氣N2保護下吹干，干燥后的樣本在65℃條件下用60μl 乙酰氯和正丁醇（1∶9）混合液衍生化20 min，衍生化的溶液在N2保護下再次吹干，最后將每個干燥的樣本溶解在100μl 新鮮流動相溶液中以備進行代謝組學分析。

1.3 代謝組學分析

通過美國AB SCIEX 公司API 3200MD 質譜分析儀進行直接注射法質譜分析，該儀器在正離子電噴霧離子源下運行，每次運行時注入20μl 樣本，以50%+50%乙腈，進行梯度洗脫。洗脫程序以0.2 ml/min開始，隨后在0.08 min 內降到0.01 ml/min 并維持1.50 min，之后在0.01 min 內再次升高到0.2 ml/min并維持0.5 min。離子源噴霧電壓設為4.5 kV，離子源氣體壓力設定為35 磅/ 平方英寸（psi）（1 psi=6.895 kPa），屏障氣體壓力設為20 psi，輔助氣體溫度保持在350℃，液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）分析儀掃描方式采用母離子掃描（precursor ion,Prec）、中性丟失（neutral loss, NL）及多反應監測（multiple reaction monitor, MRM）3 種掃描模式。

1.4 統計學方法

數據分析采用Excel 和SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或配對t檢驗或方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血漿代謝物水平比較

兩組丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、瓜氨酸（Cit）、谷氨酰胺（Gln）、甲硫氨酸（Met）、鳥氨酸（Orn）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tvr）、丁二酰基肉堿（C4DC）、葵酰基肉堿（C10）及二十四酰基肉堿（C24）比較，經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組較對照組升高。而天冬酰胺（Asn）、天門冬氨酸（Asp）、半胱氨酸（Cvs）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Glv）、同型半胱氨酸（Hcv）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lvs）、苯丙氨酸（Phe）、胡椒酰胺（Pip）、色氨酸（Trp）、丙酰基肉堿（C3）、丁酰基肉堿（C4）、羥丁酰基肉堿（C4-OH）、纈氨酸（Val）、游離肉堿（C0）、乙酰基肉堿（C2）、異戊酰基肉堿（C5）、羥異戊酰基肉堿（C5-OH）、戊二酰基肉堿（C5DC）、戊烯酰基肉堿（C5：1）、己酰基肉堿（C6）、辛酰基肉堿（C8）、月桂酰基肉堿（C12）、肉豆蔻酰基肉堿（C14）、羥肉豆蔻酰基肉堿（C14-OH）、肉豆蔻二酰基肉堿（C14DC）、棕櫚酰基肉堿（C16）、羥棕櫚酰基肉堿（C16-OH）、羥棕櫚烯酰基肉堿（C16：1-OH）、十八碳酰基肉堿（C18）、二十碳酰基肉堿（C20）、二十二碳酰基肉堿（C22）、二十六碳酰基肉堿（C26）及肉豆蔻烯酰基肉堿（C14：1）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

表1 兩組血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

組別 n Ala Arg Asn Asp Cit Cvs Gln對照組 46 146.685±51.362 5.643±3.394 68.463±23.749 24.494±8.760 24.674±9.084 1.345±0.730 8.003±4.134實驗組 120 164.927±52.247 7.537±4.096 67.577±22.757 27.722±12.542 29.089±10.738 1.492±0.734 9.485±3.987 t 值 2.023 2.912 -0.236 1.654 2.582 1.229 2.257 P 值 0.045 0.004 0.814 0.099 0.010 0.220 0.025組別 Glu Glv Hcv His Leu Lvs Met對照組 176.900±55.727 191.458±61.584 8.622±0.826 66.775±55.929 99.656±30.560 127.119±76.229 15.833±4.429實驗組 177.338±58.360 206.929±73.143 8.791±0.952 67.813±40.126 102.481±33.215 151.880±78.904 17.671±5.598 t 值 0.046 1.329 1.110 0.146 0.527 1.930 1.998 P 值 0.963 0.185 0.268 0.884 0.598 0.055 0.047組別 Orn Phe Pip Pro Ser Thr Trp對照組 12.790±4.915 46.817±21.731 242.953±94.378 405.181±199.432 47.969±13.417 22..603±7.927 40.823±10.193實驗組 15.494±6.857 42.474±13.106 275.573±129.372 464.549±174.898 51.815±16.636 26.172±9.063 44.640±11.889 t 值 2.527 -1.760 1.613 2.020 1.402 2.462 1.922 P 值 0.012 0.080 0.108 0.045 0.163 0.015 0.056組別 C3 C4 C4-OH Tvr Val C0 C2對照組 1.446±0.504 0.161±0.069 0.042±0.024 54.830±16.219 143.245±36.039 26.072±8.309 14.200±5.335實驗組 1.486±0.675 0.181±0.081 0.046±0.030 61.322±16.636 136.524±33.414 28.125±10.619 13.275±5.672 t 值 0.378 1.56 0.746 2.266 -1.212 1.227 -1.008 P 值 0.706 0.120 0.456 0.025 0.227 0.221 0.314組別 C4DC C5 C5-OH C5DC C5：1 C6 C8對照組 0.221±0.099 0.113±0.055 0.127±0.043 0.069±0.051 0.026±0.015 0.082±0.033 0.095±0.059實驗組 0.291±0.171 0.116±0.062 0.142±0.071 0.075±0.045 0.030±0.025 0.087±0.050 0.117±0.097 t 值 3.684 0.296 1.895 0.713 0.958 0.616 1.477 P 值 0.000 0.768 0.061 0.476 0.339 0.539 0.141

續表1

2.2 不同臨床分期結直腸癌患者血漿代謝物水平比較

結直腸癌患者0 期1例（由于數據過少，為防止對結果造成偏倚現象，故去掉），結直腸癌患者Ⅰ期14例，年齡53 ～81 歲，平均（66.79±8.74）歲。結直腸癌患者Ⅱ期50例，年齡43 ～86 歲，平均（64.96±9.74）歲。結直腸癌患者Ⅲ期40例，年齡46 ～89 歲，平均（64.63±10.16）歲。結直腸癌患者Ⅳ期15例，年齡51 ～82 歲，平均（70.2±8.97）歲。不同臨床分期結直腸癌患者年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。不同臨床分期結直腸癌患者C4DC 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；而Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C10 及C24 水 平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床分期結直腸癌患者血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

表2 不同臨床分期結直腸癌患者血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

分期 n Ala Arg Cit Gln Met OrnⅠ期 14 164.484±40.252 6.176±2.330 30.468±9.145 10.464±2.905 18.711±6.019 14.922±4.332Ⅱ期 50 167.348±55.789 6.992±4.405 28.688±8.524 9.655±3.833 16.892±4.862 15.133±5.236Ⅲ期 40 166.621±54.157 8.167±4.322 31.966±14.226 9.068±3.795 17.321±5.431 14.881±6.093Ⅳ期 15 149.742±47.040 7.091±3.513 25.471±8.881 10.436±6.139 20.231±7.563 15.934±6.912 F 值 0.323 1.486 0.02 0.876 0.206 0.425 P 值 0.570 0.223 0.887 0.349 0.650 0.514分期 Pro Thr Tvr C4DC C10 C24Ⅰ期 473.424±147.125 27.483±6.962 65.204±15.734 0.309±0.219 0.115±0.070 0.029±0.017Ⅱ期 467.875±133.380 23.569±7.503 60.739±15.848 0.242±0.146 0.094±0.081 0.026±0.013Ⅲ期 502.134±244.446 26.777±8.684 63.879±14.283 0.295±0.143 0.106±0.069 0.026±0.013Ⅳ期 463.825±187.388 27.442±10.244 52.943±23.767 0.344±0.180 0.147±0.131 0.033±0.017 F 值 1.093 1.667 1.708 4.728 0.213 2.368 P 值 0.296 0.197 0.191 0.030 0.645 0.124

2.3 結直腸癌患者手術前后血漿代謝物水平比較

結直腸癌患者術前與術后Ala、Cit、Gln、Orn、Pro、Thr、C10 及C24 血漿代謝物比較，經配對樣本t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）；而Arg、Met、Tvr 及C4DC 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。術后Ala、Cit、Gln、Pro、C10、C24 水平較術前降低（P＜0.05）；而Orn、Thr 水平較術前升高（P＜0.05）。見表3。

表3 結直腸癌患者手術前后血漿代謝物水平比較 （n =119，μmol/L，±s）

表3 結直腸癌患者手術前后血漿代謝物水平比較 （n =119，μmol/L，±s）

時間 Ala Arg Cit Gln Met Orn術前 162.667±48.421 7.213±4.031 29.846±11.121 9.687±4.185 17.237±5.233 14.944±5.323術后 134.346±42.861 7.545±8.766 19.948±11.222 8.212±4.257 18.242±6.125 23.321±27.223 t 值 5.294 -0.414 6.991 2.619 -1.480 -3.212 P 值 0.000 0.680 0.000 0.010 0.142 0.002時間 Pro Thr Tvr C4DC C10 C24術前 479.133±190.451 25.501±8.103 61.548±14.586 0.263±0.143 0.104±0.077 0.027±0.013術后 353.314±134.323 28.170±11.436 64.390±20.070 0.238±0.138 0.063±0.050 0.023±0.012 t 值 6.160 -2.341 -1.26 1.955 5.133 2.579 P 值 0.000 0.021 0.210 0.053 0.000 0.011

3 討論

結直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一[6]，其體內的代謝方式發生改變，特別是氨基酸代謝。氨基酸作為組成蛋白質的基本單位，參與體內多種生理及病理變化，本研究中使用LC-MS/MS 檢測血漿代謝物水平的改變，并分析其是否可用于結直腸癌的早期診斷。

本研究結果顯示結直腸癌組血漿中的Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C4DC、C10、C24 較對照組升高，與MIYAGI 等[7]研究結果基本一致。其中Gln 水平的變化與NISHIUMI 等[8]的研究結果相一致。Gln 是機體最豐富的非必須氨基酸，也是惡性腫瘤消耗最多的氨基酸。TODOROVA 等[9]認為，補充Gln 能夠抑制IGF-1 激活的PI-3K/Akt 信號通路，而此通路是腫瘤生成和延長腫瘤細胞存活時間所必須的。Gln 也是腫瘤細胞中，除葡萄糖外的主要供能物質[10]，德國學者WARBURG[11]教授曾提出，腫瘤細胞即使在氧充足的情況下也主要依靠糖酵解來提供能量即Warburg 效應。由于Warburg 效應，惡性腫瘤產生的丙酮酸不能進入三羧酸循環，在ALT 作用下接受谷氨酸的氨基生成Ala。IKEDA 等[12]研究發現，結直腸癌患者血清中的Ala 水平也較對照組高。

此外，對結直腸癌患者行常規根治性手術治療后，為減少手術對患者的影響，術后約1 周于晨起空腹采血行串聯質譜檢查。本實驗結果顯示，術后Ala、Gln、Cit、Pro、C10、C24 水平較術前降低，而Orn、Thr 水平較術前升高。推測Ala、Gln、Cit 及Pro 代謝物水平的前后變化最可能是因為手術去除腫瘤的結果，因此Ala、Gln、Cit、Pro、C10 及C24 與結直腸癌的關系更為密切，作為早期診斷結直腸癌標志物的可靠性更高。MA 等[13]分析大腸癌患者術前、術后的血清氨基酸，發現Val、5-氧代-L-脯氨酸等代謝物含量下降，而Tvr 上升，但哪些氨基酸更具有價值，還需要進一步研究。

本實驗還對不同臨床分期結直腸癌患者的血漿代謝物進行比較，以進一步研究其與該疾病嚴重程度的關系，結果顯示Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期比較，僅發現C4DC 水平變化有差異，其他代謝物水平無差異。HIRAYAMA 等[14]研究顯示，未發現結直腸癌患者代謝物水平與癌癥分期有相關性。QIU 等[15]報道結直腸癌患者代謝物譜與癌癥進展無相關性。也有研究表明，不同臨床分期腫瘤患者的代謝物水平變化有差異[16-17]。本實驗的結果可能也與血漿代謝物的測量方法、血漿代謝物的種類不全、覆蓋的人群不夠廣泛、地域差異等諸多因素有關。因此，結直腸癌患者的嚴重程度是否與血漿代謝物水平相關，仍需進一步研究。

酰基肉堿是肉堿與氨基酸代謝物或脂肪酸結合的一種酯類物質，肉堿是氨基酸代謝和脂肪酸β-氧化代謝的中間體。當氨基酸代謝或脂肪酸氧化代謝發生異常，會造成相應的酰基輔酶A 蓄積，導致血漿中的酰基肉堿發生改變。肉堿的主要生理功能包括：①肉堿作為長鏈脂肪酸唯一載體，將長鏈脂肪酸轉入線粒體內進行氧化，提供能量；②肉堿是調節細胞內外游離CoA 與酰基CoA 平衡的調節器。酰基肉堿的變化部分歸因于肉堿棕櫚酰轉移酶2（CPT2）的下調，其下調促進了肝癌的發生。LU 等[18]研究揭示，15 種酰基肉堿在肝癌中存在統計學差異，其中不同臨床分期的肝癌患者，其酰基肉堿也有差異。WILLIAMS等[19]研究證明，酰基肉堿、氨基酸及核苷等代謝譜在區分結直腸癌樣本與非腫瘤上皮，以及疾病不同階段（T1～T4）中發揮作用。目前檢測血酰基肉堿是診斷脂肪酸氧化代謝最有特異性和最直接的方法[20]。

綜上所述，本實驗結果表明Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C4DC、C10 及C24 在結直腸癌早期預測中具有重要參考價值，Ala、Cit、Orn、Pro、C4DC 及C10 在結直腸癌早期診斷中具有重要意義。但由于樣本量相對較少，對結直腸癌的早期診斷仍需要大規模的臨床研究來進一步驗證。