PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系*

馮躍，張永濤，夏利鋒，馬永剛

（中國人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院 外二科，浙江 嘉興 314000）

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率均呈明顯的上升趨勢，2015年我國結(jié)直腸癌估算新發(fā)和死亡病例數(shù)分別為37.6 萬和19.1 萬[1]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路作為細(xì)胞生長、增殖和抗凋亡的重要調(diào)節(jié)通路，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。有研究顯示，結(jié)直腸癌的惡化、轉(zhuǎn)移與PI3K/Akt/mTOR 信號通路有關(guān)[4-5]。因此，本研究通過檢測PI3K/Akt/mTOR 信號通路中人類第10 號染色體缺失的編碼與PTEN、p-Akt、p-mTOR 在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)，探究其相關(guān)蛋白對結(jié)直腸癌的影響及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2017年12月中國人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院52例外科手術(shù)切除或內(nèi)鏡完整切除的結(jié)直腸癌活檢標(biāo)本，并取相同患者的癌旁正常組織（距腫瘤切緣≥4 cm）作為對照，標(biāo)本離體后用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。患者男性30例，女性22例；年齡25 ～76 歲，平均（53.8±13.2）歲；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；浸潤未達(dá)漿膜層32例，浸潤達(dá)到漿膜層20例；低分化結(jié)直腸癌18例，中、高分化結(jié)直腸癌34例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合協(xié)會和國際抗癌聯(lián)盟的結(jié)直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)[6]，臨床分期Ⅰ、Ⅱ期患者24例，Ⅲ、Ⅳ期患者28例。

1.2 主要試劑

鼠抗人PTEN、兔抗人p-Akt、兔抗人p-mTOR 單克隆抗體均購自德國默克公司，免疫組織化學(xué)SP 試劑盒、DAB 顯色劑購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)SP 法及結(jié)果判斷

采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測PTEN、p-Akt、p-mTOR 在結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為p-mTOR 陽性，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為PTEN、p-Akt 陽性。隨機(jī)選取10 個高倍鏡視野，根據(jù)染色程度分為：無染色（-）、淺黃色（+）、棕黃色（++）、黃褐色（+++），分別代表0～3 分。根據(jù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占比例分為：≤10%（-）、＞10%～25%（+）、＞25%～50%（++）、＞50%（+++），分別代表0～3 分。最終評分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞所占比例評分，最終評分≥3 分為陽性，≤2 分為陰性。

1.4 隨訪

隨訪時間截至2020年1月31日。通過電話、信函和查閱醫(yī)院病案記錄等方式隨訪。所有患者隨訪資料完整。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，多因素分析采用Logistic 回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性率比較

結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PTEN 陽性率低于癌旁正常組織，而p-Akt、p-mTOR 陽性率高于癌旁正常組織。見表1和圖1。

2.2 結(jié)直腸癌患者PTEN、p-Akt、p-mTOR 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的p-Akt 和p-mTOR 陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較高。腫瘤浸潤達(dá)到漿膜層與未達(dá)漿膜層患者的p-Akt 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤浸潤達(dá)到漿膜層患者較高。腫瘤低分化與高、中分化患者的p-Akt 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低分化患者較高。臨床分期Ⅲ期、Ⅳ期與Ⅰ期、Ⅱ期患者的p-Akt和p-mTOR 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Ⅲ期、Ⅳ期患者較高。其余臨床病理特征患者的PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性率比較 [n =52，例（%）]

圖1 PTEN、p-Akt、p-mTOR 在結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá) （SP×100）

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者的PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性率比較例（%）

續(xù)表2

2.3 p-Akt 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的多因素分析

以表2中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素為自變量，p-Akt 是否陽性為因變量，進(jìn)行一般多因素Logistic 回歸分析（引入水準(zhǔn)為0.05，剔除水準(zhǔn)為0.10），結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌患者臨床分期Ⅲ、Ⅳ期[=4.098（95% CI：2.337，7.134）]是p-Akt 陽性表達(dá)的影響因素（P＜0.05），見表3。

2.4 PTEN、p-Akt、p-mTOR 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

52例隨訪患者中，死亡30例。PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性與陰性患者的4年生存率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PTEN 陽性患者高于陰性患者，p-Akt、p-mTOR 陽性患者分別低于p-Akt、p-mTOR 陰性患者。見表4和圖2～4。

表3 結(jié)直腸癌患者病理特征的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

表4 PTEN、p-Akt、p-mTOR 陽性與陰性患者的4年生存率比較 %

圖2 PTEN 陽性和陰性結(jié)直腸癌患者的生存曲線

圖3 p-AkT 陽性和陰性結(jié)直腸癌患者的生存曲線

圖4 p-mTOR 陽性和陰性結(jié)直腸癌患者的生存曲線

3 討論

結(jié)直腸癌可以通過淋巴、血液循環(huán)及直接浸潤等途徑，播散到其他組織和臟器，因此治療的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、及時診斷和手術(shù)根治[7-8]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路作為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在多種腫瘤中異常激活[9-11]。PI3K/Akt/mTOR 與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期密切相關(guān)[12]。在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中，c-FOS和PTEN可能是該通路的關(guān)鍵基因改變[13]。mTOR作為下游基因，活化后可以抑制癌細(xì)胞自噬。凋亡也是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，PI3K/Akt 通路可以通過Caspase、Bcl、FOXO和mTOR基因抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡[14-15]。值得一提的是，PI3K/Akt/mTOR 通路還能通過調(diào)控血管形成而影響化療藥物的耐藥性[16-17]。因此，探究PI3K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)具有潛在價值。

PTEN抑癌基因具有雙重特異性磷酸酶活性，能將三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇二磷酸，是PI3K/Akt/mTOR 信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)通路[18-19]。PTEN 在結(jié)直腸癌組織中的陽性率低于癌旁正常組織，說明PTEN 的低表達(dá)或不表達(dá)，導(dǎo)致結(jié)直腸細(xì)胞生長狀態(tài)失控，進(jìn)而使腫瘤發(fā)展成癌癥的可能性增加。從臨床病理特征上看，PTEN 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、腫瘤分化程度、臨床分期均無關(guān)。預(yù)后分析中，PTEN陽性患者4年生存率高于陰性患者，說明PTEN 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)。

Akt 在多種細(xì)胞生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如葡萄糖代謝、凋亡、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞遷移，Thr308 和Ser743 位點(diǎn)可以被磷酸化，從而激活其底物mTOR[20]。在本研究中，p-Akt 在結(jié)直腸癌組織中的陽性率高于癌旁正常組織，說明Akt 的活化與結(jié)直腸癌發(fā)展相關(guān)。從臨床病理特征上來看，Akt 的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、腫瘤分化程度、臨床分期有關(guān)，且與賀雅靜[21]的研究中p-Akt 在其他消化道癌癥中的作用吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了p-Akt 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。Logistic 回歸分析顯示p-Akt 與結(jié)直腸癌患者的臨床分期有獨(dú)立影響關(guān)系，p-Akt 可以作為臨床上判斷結(jié)直腸癌惡性程度的重要指標(biāo)之一，也是治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。同時，p-Akt 陽性患者4年生存率低于陰性患者，說明p-Akt 表達(dá)可能會加重結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR 活化后介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR 信號通路下游分子，影響細(xì)胞的生長、凋亡及代謝[22-23]。本研究中p-mTOR 在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，說明mTOR 磷酸化與結(jié)直腸細(xì)胞癌變有關(guān)。同時，p-mTOR 在結(jié)直腸組織中的陽性表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，說明mTOR 功能失調(diào)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；p-mTOR 陽性患者4年生存率低于陰性患者，說明p-mTOR 表達(dá)可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者預(yù)后惡化。

抑制PI3K/Akt/mTOR 通路對結(jié)直腸癌的治療有重要意義[24-25]。目前已進(jìn)入臨床研究的藥物，如PI3K 抑制藥LY294002，PI3K 和mTOR 雙重抑制藥NVP-BEZ235，mTOR 抑制劑依維莫司和替西羅莫司等均顯示出一定療效。并且針對不同PI3K 亞型的特異性化合物也正在被開發(fā)，如p110β 特異性抑制藥IC87114，p110γ 特異性抑制藥AS-24252[16]。總之針對PI3K/Akt/mTOR 通路開發(fā)潛在靶向藥勢必會使結(jié)直腸癌患者受益。

綜上所述，PI3K/Akt/mTOR 信號通路與結(jié)直腸癌密切相關(guān)，PTEN、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)都會影響到結(jié)直腸癌的發(fā)展，同時p-Akt、p-mTOR 與結(jié)直腸癌患者的一些臨床病理特征有關(guān)，可以作為臨床參考指標(biāo)，并且PTEN、p-Akt、p-mTOR 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后生存率有關(guān)，可以用于推測患者的預(yù)后。盡管PI3K/Akt/mTOR 信號通路中仍有許多相關(guān)蛋白和基因沒有進(jìn)行探究，影響機(jī)制尚不明確，但是本研究中的PI3K/Akt/mTOR 信號通路為臨床提供了新的參考指標(biāo)，PI3K/Akt/mTOR 信號通路中的p-Akt、p-mTOR蛋白有潛力作為結(jié)直腸癌的新治療靶點(diǎn)。