骨質疏松骨折相關血清外泌體的對比分析

高春林 許永峰 劉立軍 黃洪斌 王金海 袁博 盧立軍

骨質疏松是老年人常見的疾病,會導致腰背痛、活動能力下降等影響日常生活的癥狀,嚴重的會出現骨質疏松骨折如髖部骨折、脊椎骨折、腕部骨折等并發癥,嚴重影響老年患者的生活質量［1］。骨質疏松的發生與骨吸收/骨形成之間平衡失調有關,在骨吸收/骨形成的平衡調節中,外泌體中的miRNA 起著重要的作用［2］。外泌體是一類能與細胞膜結合的納米囊泡(直徑30～100 nm),研究表明,外泌體內的多種成分如蛋白質、mRNA、miRNA 等信號分子在細胞間信息傳遞中起重要作用［3］。miRNA 通過與轉錄本的相互作用,關閉或者抑制基因的表達,在調節骨穩態中具有重要作用。目前骨質疏松的診斷主要依據影像學診斷,如X 線片和骨密度檢查等,目前尚無敏感度高的生物學指標。本研究對比分析骨密度正常的老年人和嚴重骨質疏松骨折的老年患者血清外泌體中miRNA,獲得差異化表達的miRNA,為進一步研究骨質疏松骨折風險的評價指標和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年6～12 月于本院骨科門診及病房診治的年齡>65 歲明確診斷為嚴重骨質疏松骨折的老年患者8 例作為A 組,選取同期年齡>65 歲的正常老年人8 例作為B 組。16 例研究對象的平均年齡為(68±6.83)歲。A 組的平均年齡為(67±7.3)歲,B 組的平均年齡為(69±5.1)歲。兩組的年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。其中,A 組除特征性的髖部、腕部、肱骨近端、胸腰椎骨折外,骨密度的診斷標準為WHO 推薦的診斷標準：雙能X 線吸收測定的骨密度T 值<-2.5 SD,B 組的骨密度T 值：-2.5 SD

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取 藍帽采血管采集受試者的空腹靜脈血10 ml,靜置后,2000 r/min,離心15 min,留取血清后裝入EP 管,置入-80℃的冰箱中冷凍備用。每組隨機選取3 例受試者的血清,3000 r/min,離心15 min 后,取上清,加入63 μl ExoQuicktm precipitation 外泌體提取試劑(4∶1),混合均勻后,4℃條件下放置30 min,將孵育好的樣品室溫下1500 r/min,離心30 min,棄上清,沉淀以100 μl PBS 重懸,即可獲得血清外泌體懸液,分裝,備用樣品于置入-80℃保存［4］。

1.2.2 miRNA 的提取和識別 使用TRIzol 試劑提取外泌體中的miRNA,用ND-1000nanodrop 進行樣品的質檢,通過質檢的樣品進行小RNA 文庫構建和序列分析(Yingbio 公司)［5］。將結果進行數據分析后檢測其外泌體中的miRNA 表達情況,兩組間進行對比,得到差異較大且表達量較高的miRNA。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗。用log2Ratio 方法定量分析兩組間差異表達的miRNA。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

兩組有表達的miRNA 共728 個,其中有顯著差異的miRNA 共29 個。篩選出兩組表達差異倍數較大、表達量較高的miRNA 共17 個,其中上調的miRNA 共12 個,下調的miRNA 共5 個。見表1。

3 討論

隨著核酸測序技術的發展,目前出現了大量關于非編碼小RNA 的研究,尤其是關于miRNA 的研究。miRNA 被認為是許多嚴重疾病如惡性腫瘤、慢性代謝性疾病等基因調控網絡中重要調節因子。許多研究表明,miRNA 或許可作為許多疾病如惡性腫瘤的診斷標志物［3］。外泌體是細胞間信息傳遞的重要形式,它可以在細胞間傳遞蛋白、DNA 和各種非編碼小RNA,如miRNA、tRNA 來源的小片段RNA(transfer RNAderived fragments,tRF)等,這類非編碼小RNA 作為細胞代謝調控的重要分子被廣泛研究［5］。

骨質疏松是老年人的常見病,輕則可以導致腰背部慢性疼痛,重則可以誘發骨質疏松骨折如脊椎壓縮骨折、髖部骨折等,嚴重影響老年人的生活質量［1］。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)、成骨細胞、破骨細胞都可以分泌外泌體［2］,同時這些細胞膜上也都有外泌體的受體,外泌體中包含的miRNA 對成骨細胞、破骨細胞活性的調節起重要作用。唐煜等［6］發現血清外泌體包含的miR-214-3p 和切除卵巢小鼠的骨形成減少有關。來源于礦化階段的MC3T3-E1 細胞外泌體中多種miRNAs 水平升高,如miR-30d-5p、miR-133b-3p 和miR-140-3,他們可能通過多種途徑(如Wnt、insulin、TFG-B、鈣離子信號通路)影響成骨細胞的分化和功能。miR-199b、miR-221 和miR-885-5p 可通過RUNX2 來調節成骨細胞的分化。骨細胞外泌體來源的miR-218 可以通過激活Wnt 信號通路來促進成骨分化［7-9］。

關于循環miRNA 與骨質疏松的研究近年來逐漸增多。黃大耿等［10］對比分析了骨質疏松骨折組和非骨質疏松組,發現其中83 種miRNA 有差異,9 種miRNA(miR-21、miR-23a、miR-24、miR-93、miR-100、miR-122a、miR-124a、miR-125b、miR-148a)在 骨 質疏松骨折患者的血清表達明顯增高,有可能作為嚴重骨質疏松的診斷標志物。陳逸青等［2］對比分析骨質疏松患者和非骨質疏松患者的血清,發現3 種miRNA(miR-122-5p、miR-125b-5p、miR-21-5p 表達顯著上升,miR-21-5p 的表達和骨吸收標志物CTx 相一致,提示miR-21-5p 可作為骨折生物標志物。miRNA 作為疾病的診斷物具有如下特點：①miRNA 具有高度的保守性,在同一物種內表達較為穩定,發揮其生物學功能,當機體出現異常變化時,相對保守的miRNA 的表達亦出現顯著變化。②外周血中循環miRNAs 可因疾病的變化而變化,這樣miRNA 在一定程度上能反應疾病的輕重程度。③miRNA 發揮作用的機制為網狀調節,即一個miRNA 可同時影響多個靶基因,而一個靶基因也可能被多個miRNA 影響,這種網絡化的作用使得由多個miRNA 構成的miRNA 組合與疾病關聯的可能性增大。④miRNA 具有組織或(和)細胞特異性,有的miRNA僅在某種特定的細胞或組織中表達,有的miRNA 可出現在外周血當中。此外,外泌體來源的miRNA 還具有以下特點:①外泌體內miRNA 受到血漿中成分的影響較少,成分與性質相對穩定,這樣分析結果更精確。②血漿外泌體是細胞間、組織間通訊重要的介質,能隨著血流影響到全身各個器官組織,廣泛地參與機體各個病理生理過程,其調控范圍更廣,其內的miRNA的變化對各器官組織的影響更大,更具有診斷價值。③外泌體除了miRNA 外還包含有其他類型的信息,如蛋白質、脂類等,若能聯合分析miRNA 與外泌體內的蛋白質組,方便從更多維度的鑒別疾病。④目前已證實,外泌體內miRNA 是具有時間特異性的,是個體、器官、組織特定階段的特定性標志。即特定的外泌體和外泌體內miRNA 代表著細胞、組織特定的狀態,研究外泌體來源的miRNA 將有助于縮小疾病標記物篩查的范圍,并且有助于了解特定細胞的特定狀態,有助于對疾病可能機制的探索。

在作者的研究中,通過提取正常老年人和骨質疏松骨折的老年人體內血清中的外泌體并分離出miRNA,利用qt-PCR 的方法擴增分離得到miRNA,再通過測序和對比文庫的方法確定差異化表達的miRNA 其各自的表達水平,將兩組間進行對比分析,得到了的這些有差異的miRNA,再結合既往的文獻進行分析,篩選出的骨質疏松骨折特征性的miRNA,這些特征性的miRNA有望能作為嚴重骨質疏松特征性標志物。通過對比分析,作者發現了17 種miRNA 的表達有明顯差異,其中在嚴重骨質疏松患者中,12 種的表達明顯升高,5 種表達明顯降低,其研究結果與其他文獻的研究結果基本一致［8-10］。在差異化最顯著的幾個miRNA 中,miR-7843-5p 已在前人報道中發現了其與骨質疏松有關,在去卵巢骨質疏松小鼠模型的骨組織中,miR-7843-5p表達高于對照組,miR-7843-5p 通過作用于RUNX2 基因,負向調控成骨細胞分化［10］。MiR-3605-5p 參與基質蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的調控,此蛋白酶與Ⅰ型膠原降解密切相關。MiR-3605-5p 表達的降低,可能與巨噬細胞/破骨細胞功能激活有關,從而導致骨質疏松［9］。miR-6747-3p 參與骨相關細胞的分化及功能調控,miR-6747-3p 可通過抑制Smadl,從而干擾Smadl/SMad4 介導的基因激活通路,從而抑制軟骨細胞分化［4］。

本研究對比分析了骨質疏松骨折的患者人群與正常老年人群之間差異化表達的miRNA,所獲得的miRNA 對骨質疏松骨折具有較好的預警作用。下一步的研究將從中挑選2～3 個miRNA 作為重度骨質疏松的生物學診斷指標或骨折的預警指標。此外,本研究結果不可避免的具有一定的局限性：①由于選取的患者均是來本院治療的患者,樣本的選擇具有一定的偏性。②此研究中作者得到了17 種差異表達的miRNA 能否作為診斷骨質疏松骨折或者作為判斷骨折風險的指標,需要進一步的理論分析、機制研究和實驗驗證,這也是下一步的研究方向。