丹參注射液對神經病理痛大鼠DRG神經元P2X3受體的影響

張曉丹

神經病理痛已經被認定為慢性疾病,其發生與神經元、神經膠質細胞等的作用影響有關,因此,在臨床中很難被治愈。丹參的藥理活性體現在改善腦缺血再灌注損傷、血小板功能、血液流變學等方面,有鎮痛效果的可能性［1］。本研究分析丹參注射液對CII 大鼠P2X3 受體表達的影響,報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取由某醫學院實驗動物中心提供的SD 大鼠18 只,均已成年,雄性,將其在室溫下進行飼養,不限制飲食。取250 g±25 g SD 雄性大鼠隨機分為對照組、CCI 模型組、CCI+丹參注射液組,每組6 只。

1.2 研究方法 ①建立CCI 大鼠動物模型：隨機將大鼠分為對照組進行假手術,CCI 模型組與SF+CCI 模型組均建立疼痛模型,SF+CCI 模型組單獨進行丹參注射液治療。②動物行為學方法：觀察丹參注射液對CCI 大鼠痛覺行為的影響(測定痛閾)：測定各組動物機械剌激及熱剌激痛覺過敏現象。③免疫組織化學反應：先用兔抗P2X3(1∶500,CHEMICON International,Inc.)及生物素標記羊抗兔IgG 二抗血清(P2X3 和p38,1∶200,Vector,Burlingame)分別進行抗生物素-生物素-辣根過氧化酶(ABC)免疫組化法反應,DAB 呈色。然后進行免疫細胞化學P2X3 和p38 雙重標記染色觀察。采用Image-Pro Plus 圖像分析系統對免疫組化反應結果的反應密度進行觀察并予以分析。對所有組別大鼠背根神經節免疫組化反應結果進行對比分析。④原位核酸分子雜交試驗：用地高辛標記的P2X3 和p38 寡核苷酸探針對各組大鼠背根神經節標本進行原位雜交。⑤逆轉錄(RT)-PCR 檢測：分別提取各組大鼠背根神經節標本總RNA 進行RT-PCR 檢測,PCR 產物經瓊脂糖凝膠電［2］。⑥Western blot 分析：分別提取各組大鼠背根神經節標本蛋白,電泳樣品分離后轉移到硝酸纖維素膜上,用兔抗P2X3 和p38(1∶500,CHEMICON International,Inc.)及生物素標記羊抗兔IgG 二抗血清(P2X3 和p38,1∶200,Vector,Burlingame)進行抗生物素-生物素-辣根過氧化酶(ABC)反應,進行半定量統計分析。

1.3 細胞面積測量以及數量統計 采用系統隨機抽樣法,在對照組和CCI 模型組、CCI+丹參注射液組的DRG 標本中進行片子挑選,每組挑選30 張,將OLYMPUS 顯微鏡的視野調節至適當水平,將挑出的組織切片置于該顯微鏡下收集陰性及陽性神經元,收集過程中需進行拍照,各50 張,同時利用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統,該系統中的面積測定功能可以完成對免疫陽性細胞、免疫陰性細胞面積的測定,分別計算對照組和CCI 模型組、CCI+丹參注射液組大鼠免疫陽性細胞的占比,按照百分比來計算,對各個區間內免疫陽性細胞面積的數量進行統計,對不同區間內免疫陽性細胞在總細胞中的占比進行計算［3］。

1.4 主要實驗儀器 倒置顯微鏡 (Olympus,日本)1臺；超凈工作臺(國產)1 臺；分析天平 (國產)1 臺；電熱恒溫干燥箱(國產)1 臺；電熱恒溫水浴箱(國產)1 臺；隔水孵箱(國產)1 臺；低溫冰柜(國產)1 臺；高壓蒸汽滅菌器(國產)1 臺；電子天平(國產)1 臺；德國艾本德公司生產的低溫超速離心機和分光光度計各1 臺；Thermomixer(Eppendorf 公司)1 臺；電泳儀(Bio-Rad 公司)1 臺；垂直式電泳槽(Bio-Rad 公司)1 臺；硝酸纖維素膜電轉系統(Bio-Rad 公司)1 臺；凝膠成像系統。

2 結果

2.1 正常大鼠DRG P2X3 受體表達 對照組中的所有大鼠背根神經節處存在感覺神經元細胞,其屬于P2X3受體免疫陽性反應,細胞被染色,呈現為深藍色,胞漿的標記的關鍵處,胞核未被染色。免疫陰性反映中的感覺神經元細胞染色不深,強度有所不同。P2X3 受體免疫陽性反應細胞大部分為小細胞,在總細胞數中所占比例達到31.6%。對細胞面積進行測量,并統計其數量后,P2X3 受體免疫陽性反應細胞面積的平均值達到(344.03±10.59)μm2。

2.2 各組術前術后的疼痛程度比較 術后1～24 d,SF+CCI 組疼痛程度均低于CCI 組與對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組術前術后的疼痛程度比較()

表1 各組術前術后的疼痛程度比較()

注：與SF+CCI 組比較,aP<0.05

2.3 免疫組化檢測DRG 神經元P2X3 免疫反應 P2X3受體的表達在CCI+SF 組為(173.81±2.96),低于CCI 組的(282.31±2.69),差異有統計學意義(t=66.447,P<0.05)。

3 討論

慢性炎癥痛很容易引發痛過敏、觸誘發痛等,但是具體的發生機制尚不明確,需要進一步進行研究。大量研究表示,C 纖維以及Aδ 纖維會受到外周炎癥的影響,興奮度會有所增強［4］。C 傳入纖維緊密聯系于P2X3 表達小細胞。背根節小細胞存在P2X3 表達,小細胞的占比較高,其屬于具有傷害性的感受器,說明腺嘌呤核苷三磷酸發生傷害性感受器激活時,腺嘌呤核苷三磷酸發揮了介導作用。其他相關研究也指出,發生面部慢性炎癥痛后,P2X3 表達的小細胞面積平均值有所增加,大細胞比例也有所上升。有研究結果顯示,對照組大鼠的P2X3 受體表達分布依然以中小型細胞為主［5］。

為發生異常的情況下,感覺神經節中的大細胞與中樞神經系統進行觸覺刺激傳送時,主要是經由AB 纖維來完成的。大量研究證實,炎癥痛影響了AB 纖維的化學表型使其發生了變化,與此同時,在無異常情況發生時,背根神經節細胞可以選擇是否表達P 物質。

三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)是重要能量物質。大部分學者表示,ATP 是作為遞質存在于外周與中樞神經系統之間。以腺苷和ATP 的選擇親和力為依據,對“嘌呤受體”進行區分,共有兩大類型,即P1 受體和P2 受體。P2X 受體歸屬于離子通道受體家族,所包含的氨基酸有379～595 個,跨膜結構域2 個,保守序列以胞外環結構為集中位置。翻譯后修飾有兩類,即糖基化和磷酸化。現如今,應用分子克隆技術對哺乳動物P2X 受體亞單位進行克隆,已經成功獲得7 個。ATP 刺激細胞興奮性被P2X 受體激活后,興奮性氨基酸得以大量釋放,傷害感受性反映被激發,出現細胞凋亡。功能性P2X 受體近似與配體門控離子通道,其組成結構中包含大量的亞單位組合。在P2X 受體中,P2X2/3、P2X3、P2X4、P2X7 受體均與神經病理痛有密切聯系。P2X3 受體在表達背根神經節、結狀神經節、三叉神經節等初級傳入感覺神經時具有一定的選擇性,主要包括中小型神經節細胞［6］。P2X 受體與神經病理痛有密切關聯,其中以P2X2/3、P2X3 受體為主。DRG 胞體P2X3 受體被交感神經所釋放出的ATP激活后,在神經病理痛中發揮影響,ATP 的釋放可以協同神經肽和去甲腎上腺素,DRG 感覺神經元因此被激活進而產生疼痛感。初級傳入感覺神經元被P2X3 受體表達時,植物凝集素B4(IB4)、瞬時感受器電位香草酸受體1 (TRPV1)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)或P 物質也可能會參與其中,表示該受體會影響痛信息處理。機體所感受到的疼痛程度受到P2X3 受體的影響,其表達上調或者活性增強均可能讓痛感加劇,反之則痛感得到緩解。目前,關于疼痛的治療研究更加偏向于P2X3 受體功能與數量的調節機制類型、P2X3 受體表達下降或者脫敏的方法等［7］。相關研究結果發現,P2X3 受體激動劑的內向電流受到前列腺素E2(PGE2)、神經生長因子 (NGF)、P 物質和谷氨酸等的影響會有所增強,P2X3 受體功能因此可在短時間內迅速上調。傳入神經活化和炎癥反應經P2X 受體作為介導,受到癌癥痛和慢性神經病理痛的影響。P2X3 受體克隆取得成功后,其功能性在背根神經節被發現,這一發現為首例,經深入研究后發現,P2X3 受體表達僅局限于初級感覺神經元,尤其是小直徑背根神經節,其對傷害性感受尤為明顯。在背根神經節中,P2X 受體受到ATP的影響,與神經病理痛的發生、感覺信息傳遞等密切相關。出現神經病理痛的情況下,在背根神經節中,P2X3 受體mRNA 和蛋白表達明顯增強［8］。從實驗結果可以看出,P2X3 受體與神經病理性疼痛存在緊密的聯系,在預防和治療神經病理痛時可作為靶點。所以,特異性的P2X3 受體阻斷劑可應用于預防和治療神經病理痛。

丹參屬于唇形科,是一種科鼠尾草植物,在活血化瘀的中藥材中應用率較高,在《神農本草經》中首次被記載,并認為其屬于草部上品。丹參味道微苦,屬寒性,其主要功效包括活血化瘀、調經止痛、養血安神、清心去燥等。古人認為,丹參的功效可抵當歸、地黃、芍藥、川穹,其具備當歸補血生血、芍藥調血斂血、川穹生新祛瘀的功效。丹參之所以可以起到活血祛瘀的作用,主要是因為其有養血功效。丹參是一種傳統中藥材,同時也在現代醫學研究中占據重要地位。其由多種化學成分組成,主要包括水溶性酚酸類化合物、脂溶性二萜醌類化合物。近些年,有研究指出,在治療腦缺血再灌注損傷、血小板功能缺失、血液流變學異常等方面,丹參的藥理活性較為理想。通過清除、減少自由基產生,抑制過氧化反應、抗炎癥介質,調節氨基酸類神經遞質保護神經元,抑制凋亡細胞等實現藥理活性。由此提示丹參可能具有鎮痛作用。

綜上所述,丹參注射液可抑制CII 大鼠P2X3 受體的表達,對外周神經疼痛的緩解作用主要通過免疫抑制劑抗炎效果來實現。