間充質干細胞外泌體在針刺治療缺血缺氧性腦病中的作用研究進展

季一峰，鮑超，李彥彩，陳棟

(南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029)

缺血缺氧性腦病(Hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是腦組織缺血缺氧引起的腦部病變，其中新生兒HIE最為常見[1]。HIE分為輕、中、重三種程度，臨床表現上，輕度常出現興奮癥狀，中度以抑制癥狀為主，重度則可至昏迷。研究表明[2]，我國HIE發病率可達活產新生兒的3‰～6‰，其中死亡于新生兒期的患兒約占15%～20%。存活的患兒亦有20%～30%留下神經系統損傷，如腦癱、癲癇、智力障礙、感覺障礙或學習障礙[3-4]，給本人、家庭與社會都造成沉重的負擔。

HIE至今尚無完整統一的治療方案，治療上主要以糾正缺血缺氧為主。亞低溫治療是目前公認治療新生兒腦病有效的療法，但是其安全性仍未明確[5]，甚至存在著硬腫及彌散性血管內凝血的風險[6]。針刺治療HIE已被證實確有療效[7]，然而，其作用機制仍需進一步研究。目前許多研究證實，間充質干細胞外泌體(mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exo)能夠減少神經元細胞凋亡，促進神經功能恢復，達到腦保護作用[8]。基于此，本文分析了MSC-Exo及其介導的細胞凋亡與HIE的關系，探討了MSC-Exo在針刺治療HIE中的可能作用。

1 細胞凋亡與HIE的相關性

1.1 細胞凋亡是導致HIE的重要因素

HIE的病因是由各種原因所致的腦組織缺血缺氧，其中圍產期窒息是最主要的原因[9]。HIE的發病機制尚未明晰，一般認為可能與炎癥反應、細胞凋亡、免疫功能改變有關[10]，最終引起腦水腫、神經膠質增生、神經元壞死等腦組織病理性損害[11]。其中，細胞凋亡在HIE的發生發展中起著重要作用。

細胞凋亡，是細胞為了保持內環境穩態，在基因調控下有序、自主地死亡。細胞凋亡對機體的生長發育有著重要的作用[12]。細胞內外的各種病理因素，都可能導致細胞凋亡的發生。

1.2 缺血缺氧下細胞凋亡的發生機制

缺血缺氧環境下，腦組織血流量下降，供氧不足，會增快神經元細胞能量消耗，加劇興奮性毒性與氧化應激反應。氧化應激加劇則會引起線粒體功能衰退，進一步增快神經元細胞的能量消耗，導致神經元細胞損傷乃至凋亡。氧化應激加劇還會使線粒體膜內外離子通透性增加，使線粒體跨膜電位改變，從而引起鈣離子超載，增加細胞負荷，導致細胞損傷與凋亡。此外，細胞凋亡又會反過來進一步加劇氧化應激，造成惡性循環，加重缺血缺氧的進展，對腦組織造成持續性損傷[13-14]。

因此，通過干預減少細胞凋亡的發生與進展，是治療HIE的一條關鍵途徑。

2 MSC分泌抗細胞凋亡的外泌體，治療HIE

2.1 MSC分泌攜帶miRNAs的外泌體

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種多能干細胞，有著自我更新與多向分化的能力，是目前生命科學的新熱點。MSC能夠分泌細胞外囊泡，將生物活性分子輸送至靶細胞，從而修復受損組織[15]。細胞外囊泡分為外泌體、凋亡小體和微泡，研究最為廣泛的是外泌體。外泌體是一類直徑在40～100 nm的脂質囊泡[16]，其內容物中包裹各種脂質、蛋白質和RNAs[17]，通過將這些物質靶向釋放，從而實現細胞間物質傳遞的作用。諸多研究證明，外泌體能夠減輕缺血缺氧下的細胞損傷與凋亡[18-20]，這可能與外泌體內容物中的miRNAs有關。

2.2 miRNAs調控細胞凋亡

miRNAs是一類由核苷酸構成的非編碼單鏈RNA分子，在細胞增長、分化以及凋亡等方面發揮巨大作用[21]。越來越多研究證明，miRNAs能夠通過調控細胞凋亡，從而干預HIE。XIAO Q X等人[22]發現，缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)大鼠的miR-410-3p水平明顯低于正常大鼠。在上調miR-410-3p水平后，HIBD大鼠的神經元凋亡指數降低，神經元存活數量增加，運動與認知能力也有所提升。YANG G等人[23]發現，在HIE模型中miR-146b-5p的過表達能減輕細胞凋亡與炎癥反應，而抑制miR-146b-5p則具有相反的作用。miR-21亦是一個重要的抗凋亡miRNA，能夠負向調節PTEN水平，激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而抑制細胞凋亡，改善腦損傷[24-25]。

由此可見，MSC來源的miRNAs能靶向作用于神經元細胞，介導神經元細胞凋亡，達到腦保護作用。

2.3 MSC的臨床運用現狀與問題

綜上，越來越多的人們開始考慮運用MSC治療HIE。MSC移植是目前臨床上的一種前沿療法。DING H等人[26]將胎盤來源的MSC移植入HIBD模型大鼠后，發現抗炎因子白細胞介素-10水平增加，炎性反應減輕，提示MSC可能通過釋放抗炎因子從而改善腦損傷。JOERGER-MESSERLI M S等人[27]發現，MSC移植能夠減輕圍產期HIE小鼠的神經元細胞凋亡，而這種作用似乎是由MSC分泌的let-7-5p調控所致的。

雖然MSC在抗凋亡方面有效，但在臨床實踐中也存在著一定的局限性。一方面，目前MSC在體外實驗中出現細胞存活率較低，移植難度較大，價格相對較貴等問題，制約著現階段臨床推廣運用使用。另一方面，對于MSC移植治療，我國尚未形成統一的標準化規程，在安全性、有效性及穩定性方面仍需進一步完善。因此，如何更有效、更低廉、更規范化地將MSC運用于HIE的治療中，是當前亟需解決的一個難題。

3 針刺調控MSC治療HIE的可能機制

3.1 中醫學對HIE的認識

HIE在中醫學中無明確病名，依照臨床表現，可歸為“五遲”“五軟”“胎弱”“胎怯”范疇。本病病位在腦，其基本病機是腦髓不充，肢體失用。病因方面，則可歸為先天稟賦不足或是后天調養失當[28]。一方面，父母精血不足，或母親孕期中疾病纏身，或早產者，致患兒先天稟賦不足，致使精血不足，腦髓不充，筋骨肌肉、四肢百骸皆失所養。正如《醫宗金鑒·幼科心法要訣》所云：“小兒五遲之癥，多因父母氣血虛弱，先天有虧”。另一方面，亦有后天感受邪毒，或難產、產傷，或臍繞頸等者，損傷腦絡，以致腦髓不充，導致四肢百骸、筋骨肌肉失養，發為本病。《誠書·論行遲》云：“又有離胎多病，與飲病乳，或過食肥甘，則疳癥所侵，血氣日憊，十有六七”。因此治療上，當立足病因病機，以健腦生髓為根本大法。

3.2 針刺治療HIE機制仍需探究

針刺療法在治療HIE方面已被臨床證實確有療效，前景十分廣闊。《素問·骨空論》云：“督脈者……貫脊屬腎……與太陽起于目內眥，上額交巔，上入絡腦”。督脈是“陽脈之海”，總督一身之陽，又貫脊背而入腦。與足太陽膀胱經相交，有著溫陽行氣，補腦生髓之效，故許多醫家都非常注重督脈的運用。此外，《素問·陰陽應象大論》認為“腎生骨髓”，因此在治療上亦當注重補腎生髓。趙梁育[29]等通過針刺督脈、任脈、膀胱經諸穴，并聯合丹參注射液治療HIE，有效率達89.47%，治療后患兒血流變、新生兒神經行為評分表(NBNA)均有顯著提高。張生玉[30]等采用“醒腦開竅”針法，針刺“四神聰”“百會”“水溝”“風池”“內關”“太沖”等穴，并結合高壓氧治療HIE，發現患兒血流變、認知功能與日常生活行為能力均優于單純高壓氧治療。

雖然目前很多研究證明了針刺對于治療HIE有效，但是作用機制尚有爭議。目前關于針刺治療HIE作用機制的研究是多方面的，涉及腦血流量、病理形態學、能量代謝、自由基代謝、細胞凋亡、突觸聯系、神經營養因子表達等，但許多機制仍需要進一步的探索。

3.3 針刺調控miRNAs抑制細胞凋亡

越來越多的研究證明，針刺能夠調控miRNAs水平，介導細胞凋亡從而產生神經保護作用。ZHOU H[31]等人用電針(Electro-acupunture，EA)刺激大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠，發現EA能夠抑制miR-191a-5p的表達，減少細胞凋亡，從而保護腦組織。SHA R[32]等人發現EA刺激MCAO模型大鼠后，大鼠miR-223的水平升高，細胞凋亡指數降低，這說明EA可能通過調控miR-223水平減少細胞凋亡，從而治療腦損傷。 ZHANG S[33]等人發現EA可以上調miR-146b的表達，減少細胞凋亡，并促進神經干細胞分化，從而改善MCAO大鼠的神經損傷。

由此可見，miRNAs介導的細胞凋亡可能是針刺治療HIE的作用機制，但起作用的miRNAs的來源仍需進一步探究。

3.4 針刺調控MSC水平

MSC-Exo能夠定向遷移至靶細胞，實現細胞間的物質傳遞，從而治療疾病。這與中醫學中的經絡相類似。經絡“溝通表里，聯系臟腑”，又“運行氣血，調和陰陽”，亦是一個進行物質傳遞，從而治療疾病的通道。因此，MSC-Exo很有可能是經絡的科學內涵之一。中醫學認為，針刺會通過經絡產生治療作用。從分子生物學角度上來看，很可能是針刺作用于MSC，通過MSC-Exo將攜帶的miRNAs釋放于靶細胞，從而產生治療作用。

如果受到針刺調控的miRNAs來源于MSC，那么針刺應當對MSC產生作用。最新研究表明，針刺確實能夠調節機體內MSC的水平。

LIU L[34]等人用電針(EA)刺激大鼠“脊中”“命門”穴位，發現外周血中的MSC水平顯著增高，由此提出，EA刺激能夠促進骨髓MSC進入外周血循環。SALAZAR T E[35]等人則通過實驗進一步明確作用機理。研究指出，在經過EA刺激后，大鼠外周血內的MSC水平明顯高于刺激前，這可能是由于EA使得大鼠下丘腦內以及下丘腦與杏仁核等鄰近腦區之間的功能連接強度增加，從而激活交感神經系統(SNS)所致，激活的SNS促進MSC釋放到外周血循環中，增加循環MSC水平并轉運到受損組織，從而輔助組織修復。

由此可見，在針刺作用下，MSC的水平提高。MSC水平提高則會產生更多的MSC-Exo作用于靶細胞，使得miRNAs表達增加，從而抑制細胞凋亡，形成腦保護作用。這可能是針刺治療HIE的分子生物學機制之一。

4 小結

目前，關于針刺通過調節MSC-Exo從而治療HIE的研究鮮有報道。但是目前已經應用于臨床的MSC移植治療方案，證明了MSC-Exo攜帶著miRNAs等物質，通過多種通路靶向作用于神經元細胞，從而介導神經元細胞凋亡，達到腦保護作用。而最新研究表明，針刺能夠調控miRNAs介導細胞凋亡，亦能調節機體內的MSC。基于此，筆者推測針刺能夠通過對自體MSC的調節，促進MSC-Exo源性miRNAs的釋放于靶細胞，從而減輕細胞凋亡，達到治療HIE的效果。在今后的研究中，深入探究MSC、MSC-Exo以及miRNAs在治療HIE中的作用，能夠為針刺治療HIE提供科學客觀的作用機制，帶來新的研究思路與研究途徑，從而更好地服務于臨床。