病原真菌對琥珀酸脫氫酶抑制劑抗性研究進展

胡偉群

(浙江省化工研究院，杭州 310000）

農作物病蟲害是影響農業持續和健康發展的重要制約因素。農藥作為控制農林作物病蟲草鼠等有害生物危害的特殊商品，在保護農業生產、提高農業綜合生產能力、促進糧油安全等方面發揮重要作用。近年來，SDHI類殺菌劑因結構新穎、活性高以及殺菌譜廣等優勢，受到各大農藥公司的高度關注，她們投入大量精力和財力開發該類藥劑。目前，有23個SDHI類殺菌劑品種已經上市，此類產品已成為市場銷售額增長最為迅速的一類藥劑，在防治各種重要植物病害中發揮重要作用。2016 年，SDHI類殺菌劑的全球銷售額為 16.91億美元，占全球殺菌劑市場銷售額的11.%[1]。但是，隨著SDHI類殺菌劑的大量使用，多種病原真菌已經對該類藥劑產生了抗性，且抗性頻率不斷發展，這在一定程度上影響了該類藥劑的防治效果。本文首先介紹 SDHI類藥劑的作用機制，在此基礎上，重點綜述病菌對該類藥劑抗性發生和發展情況，闡述抗性機制，進而討論抗性治理策略。

1 SDHI類殺菌劑的作用機制

生物通過呼吸鏈進行呼吸產生生物能。通常情況下，真菌體內一個分子葡萄糖完全氧化為CO2和H2O時，在細胞內可產生36個ATP分子，其中32個是在呼吸鏈中通過氧化磷酸化形成的。因此，呼吸鏈是研發殺菌劑的重要靶標，抑制或干擾呼吸鏈的殺菌劑常常有很高的殺菌活性。

在真菌線粒體呼吸鏈上有 6個關鍵酶復合物(I到 VI)參與電子傳遞，并通過電子傳遞產生 ATP。在復合物 I中，電子從還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)傳遞到輔酶Q，該過程由NADH-Q還原酶催化。在復合物Ⅱ中，琥珀酸脫氫酶(SDH)催化琥珀酸形成延胡索酸以及從泛醌輔酶Q還原到還原型輔酶Q的偶聯反應。然后，在輔酶Q細胞色素c氧化還原酶的催化下，輔酶Q或還原型輔酶Q將電子傳遞到細胞色素 bc1酶復合物(復合物III)。最后，細胞色素c將電子經過細胞色素a和a3氧化酶(復合物Ⅳ)傳遞到最終的受體O2。在特殊環境下，在真菌體內的電子能夠繞過正常的呼吸路徑，從輔酶Q傳遞到O2，這一途徑對氰化物不敏感，由旁路氧化酶(the alternative oxidase，也稱復合物V)催化，這種呼吸作用也稱為旁路呼吸(alternative respiration)。在呼吸電子傳遞過程中，所釋放的質子在幾個不同的位點由ATP合成酶(復合物VI)催化，經氧化磷酸化產生ATP。

琥鉑酸脫氫酶由黃素蛋白(SdhA)、鐵硫蛋白(sdhB)和另外2種嵌膜蛋白(SdhC和SdhD) 4個亞單位組成。SdhA和SdhB組成該復合體的可溶性部分，具有琥珀酸脫氫酶活性；嵌膜蛋白SdhC和SdhD將SdhA和SdhB固定在內膜上，且具有泛醌還原酶活性[2]。SDHI類殺菌劑作用于琥鉑酸脫氫酶，通過完全或者部分占據底物泛醌的位點，抑制了電子從琥珀酸到泛醌的傳遞，干擾呼吸鏈上復合體II電子傳遞，阻止其產生能量，進而抑制病原菌生長，最終導致病菌死亡[3]。藥劑與藥靶精細互作試驗表明，SDHI的酸性部分插入琥鉑酸脫氫酶的泛醌結合位點(Q位點)，與SdhC的R46和S42以及SdhB的I218和P169位氨基酸通過范德華(vdW)力相互作用；而藥劑的胺基延伸到Q位的開口部，與SdHC的W35、I43以及I30氨基酸通過vdW相互作用；藥劑的羰基氧原子與SdhB的W173和SdhD的Y91氨基酸互作；精細的藥劑-藥靶互作試驗有助于設計更加高效的SDHIs新藥劑[4-5]。

2 病菌對SDHIs抗性發生情況

盡管 SDHIs對多種病原菌有很高的抑菌活性，但由于藥劑作用于琥鉑酸脫氫酶這個單一的位點，而且該靶標蛋白存在較高的變異性，因此，國際殺菌劑抗性行動委員會[Fungicides Resistance Action Committee，FRAC(https://www.frac.info/)]將SDHI類殺菌劑歸為中等至高抗性風險藥劑。從1970年報道了第一個對SDHI類藥劑抗性的真菌突變體以來[5]，隨著SDHI類藥劑的廣泛應用，目前已經有20多種病菌對該類藥劑產生抗性，其中16種病菌在田間已經對它們產生抗性(表1)。抗藥水平及抗性頻率因不同病菌-藥劑組合而異。例如，SDHI類的啶酰菌胺 2005年在我國登記防治多種作物的灰霉病。2012-2013年測定發現，湖北不同地區草莓的灰霉病菌對啶酰菌胺抗性頻率在0～4.76%[6-7]。Zheng等人報道從山東葡萄上分離的灰霉病菌對啶酰菌胺產生了嚴重抗性，抗性菌株比例達 100%[8]。因此，在今后一段時間，隨著SDHI類藥劑的廣泛使用，我國灰霉病菌對該類藥劑的抗性問題還會加重。

表1 目前已報道的對SDHI類殺菌劑產生抗性的病原真菌

3 病原真菌對SDHIs的抗性機制

研究發現，病原菌對SDHIs的抗性主要由琥鉑酸脫氫酶復合體亞基上氨基酸突變所致。琥鉑酸脫氫酶復合體亞基上的氨基酸突變，改變了藥物與復合體的相互作用，降低藥劑與藥靶的親和力，進而引起病菌的抗藥性。目前，田間菌株對SDHIs的抗性主要由SdhB亞基突變所致。例如，灰霉病菌SdhB亞基上第 225、230或 272氨基酸位點分別發生P225L/F/T (第225位的脯氨酸突變成亮氨酸、苯丙氨酸或蘇氨酸)、N230I (第230位的天冬酰胺突變成異亮氨酸)或 H272L/R/Y(第 272位的組氨酸突變成亮氨酸、精氨酸或酪氨酸)突變，導致灰霉病菌對啶酰菌胺產生不同水平的抗性[23-24]。例如，H272L點突變的灰霉病菌對啶酰菌胺表現高水平抗性，但對其他SDHI類藥劑表現低到中等抗性；N230I點突變的灰霉病菌對啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺表現中等抗性，對吡唑萘菌胺、聯苯吡菌胺和萎銹靈等僅表現低水平抗性[25]。有趣的是，同一位點突變成不同的氨基酸，可以引起不同的抗性水平和抗性譜。例如，SdhB亞基上H272L的突變，使得灰霉病菌對所有 SDHI類藥劑均產生抗藥性；但H272Y的突變使得灰霉病菌對啶酰菌胺產生抗性，但對氟吡菌酰胺反而更加敏感[24]。目前，SdhB亞基突變引起多種病菌，包括Alternaria alternata、Alternaria solani、Corynespora cassiicola、Didymellabryoniae、Podosphaera xanthii、Sclerotinia sclerotiorum以及Stemphylium vesicarium等對SDHIs產生抗藥性。

除了SdhB亞基發生突變之外，SdhC和SdhD亞基上突變同樣引起SDHIs抗性問題。蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis) SdhC亞基第 151位發生H151R突變，導致病菌產生抗藥性。番茄早疫病菌(Alternaria solani) SdhD亞基的第133位發生H133R突變，引起病菌對SDHIs的抗性。目前，尚未有SdhA亞基發生突變引起抗藥性的報道。

最新研究還發現，小麥葉枯病菌群體中存在一類對SDHIs天然抗性的菌株，這些菌株在SDHI類藥劑使用之前已經在自然界存在。對這類菌株的抗性機制研究發現，這類菌株中除了SdhC基因之外，還有一個SdhC的同源基因(命名為ZTDHC3)，該基因同樣能夠編碼琥珀酸脫氫酶 C亞基(命名為alt-SdhC)。反向遺傳學試驗表明，alt-SdhC與正常的SdhC亞基一樣，能夠與其他3個琥鉑酸脫氫酶亞基結合，形成功能完整的琥珀酸脫氫酶酶，并且alt-SdhC蛋白中獨特的Qp位點殘基使得這類菌株對SDHIs產生抗性[26]。這些結果表明，自然界中病原真菌對SDHI類藥劑存在多種抗藥機制。

4 SDHIs抗性治理策略

由于 SDHI類殺菌劑屬于中高抗性風險藥劑，在使用一段時候后，病菌比較容易對這類藥劑產生抗性。因此，在使用藥劑過程中，必須要進行抗性治理。抗性治理的基本策略包括⑴ 實施病害綜合治理，降低病害壓力；⑵ 同一個生長季節，要嚴格限制 SDHI類藥劑的使用次數，且藥劑應該在發病初期使用，減輕藥劑對病菌群體的選擇壓力。以葡萄灰霉病為例，FRAC建議一個生長季節，一般情況下SDHI類藥劑的使用不超過3次；在一個生長季節使用 12次以上藥劑的地區，SDHI類藥劑最多只能使用4次；而且SDHI類藥劑需要和其他作用機制的藥劑輪換使用，避免連續使用。⑶ 由于SDHI類藥劑之間存在交互抗性，因此，藥劑混用時，必須將不同作用機制的藥劑進行混用，不能將 SDHI類藥劑進行混用。⑷ 要加強病菌抗藥性監測，及時了解抗性發生情況，并針對性地制定實施病害防控方案。⑸ 強化藥劑抗性機制及構效關系研究，針對抗性突變位點，設計和研發反抗性或難以產生抗藥性的新藥劑，從而克服抗性問題。