炎性小體在缺血性腦卒中的研究進展

楊越旺綜述， 胡霞敏審校

腦卒中是臨床常見的心腦血管疾病之一,其中缺血性腦卒中在卒中占比高達60%～80%，高致殘率、高致死率特點顯著[1]。其多發于60歲及以上老年人群。現研究發現，缺血性腦卒中患者人群逐漸呈年輕化趨勢。其主要原因是由于血管栓塞引起腦血流量減少、腦組織血氧供應不足，刺激內皮細胞和循環白細胞，激活血小板和凝血級聯反應，迅速啟動凝血系統，引起微血管阻塞，持續缺氧可降低一氧化氮的產生水平和血壓，并使血小板進一步粘附、聚集和血管收縮，逐漸形成缺血-閉塞-缺血的惡性循環。炎性小體是宿主防御反應的重要組成部分，它能夠識別病原體相關的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和損傷相關的分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)，并介導促炎因子的水解和釋放，從而保護人體免受病原微生物和內源性危險信號的侵害。激活后，炎性小體分泌成熟的白細胞介素-1β((interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)，引起炎癥反應并參與各種無菌炎癥性疾病的過程[2]。炎性小體在缺血性腦卒中誘導的炎癥反應中起著重要的調控作用。本文通過查閱炎性小體在缺血性腦卒中的作用的相關文獻，對炎性小體在缺血性腦卒中的作用及作用機制等方面進行綜述，為其后續藥物開發和臨床治療提供理論參考依據。

1 缺血性腦卒中與炎癥反應

炎癥反應是機體先天免疫反應，對清除有害刺激并促進組織修復的啟動發揮重要作用。卒中觸發的炎癥反應貫穿整個卒中過程，從卒中開始后不久內皮細胞的激活，到卒中后幾天到幾個月的損傷后修復階段，是影響神經元死亡的關鍵因素之一。然而，過度激活的炎癥反應對機體會造成嚴重損傷。腦缺血發生時，被激活的細胞(包括神經元、星形膠質細胞和內皮細胞)釋放IL-1β、IL-6和IL-18促炎細胞因子，誘導神經元和膠質細胞死亡。中樞神經系統(central nervous system，CNS)中小膠質細胞首先被激活，并分泌大量炎癥介質，伴隨著缺血區炎癥反應的加劇、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的破壞及多種DAMPs的釋放，共同誘導外周免疫細胞向病灶及周邊遷移，并廣泛地參與到缺血性腦卒中的炎癥及免疫反應進程。Dai等[3]研究發現D-香芹酮通過抑制大鼠腦缺血再灌注誘導的炎癥反應，從而減輕腦缺血再灌注所致海馬區和皮質區的損傷；同時，釋放的促炎細胞因子可以誘導粘附分子的表達，如細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)、選擇素(如P-選擇素，E-選擇素)和整聯蛋白。這些黏附分子對于免疫細胞，特別是中性粒細胞和單核/巨噬細胞在再灌注期間滲透到缺血區至關重要。但又往往會導致缺血再灌注損傷的二次損傷。此外，激活的神經元和神經膠質細胞釋放單核細胞化學抑制劑蛋白1(MCP-1/CCL2)，促進白細胞向受損組織遷移。然而，最近的一項研究表明[4]，白細胞在神經及血管中的積累與增加的血管滲透性和內皮細胞粘附分子的表達增強無空間相關性。盡管缺血再灌注損傷的機制仍未闡明，但研究表明白細胞滲透可以釋放各種細胞毒性劑，包括額外的促炎細胞因子(即IL-1β，IL-6等)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)產生的一氧化氮。這些MMP可能會對細胞外基質和BBB造成損傷，從而加劇腦水腫及出血，最終導致神經元和膠質細胞死亡[5]。

2 炎性小體與缺血性腦卒中

炎性小體由受體蛋白、ASC和Pro-caspase-1 3個部分構成，目前研究較多的模式識別受體為核苷酸結合和寡聚結構域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors，NLRs)和黑色素瘤因子2樣缺乏受體(absent in melanoma 2-like receptors，ALRs)。NLR家族劃分為5個亞型:含酸性反式激活結構域的NLRA、含桿狀病毒抑制劑重復的NLRB、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶募集結構域(caspase-activating and recruitment domain，CARD)的NLRC(NOD1、NOD2、NLRC3～5)、包含蛋白結構域的NLRP(NLRP1～14)和結構域未知的NLRX。ALR家族分為AIM2蛋白和γ干擾素誘導蛋白16(IFN-γ inducible Protein16，IFI16)蛋白。NLRP1、NLRP3、NLRC4、和AIM2是目前研究較廣泛的炎性小體。研究報道表明，核苷酸結合寡聚結構域樣受體(NLR)含吲結構域(NLRP)在缺血性卒中患者炎癥反應過程中起著重要作用。

2.1 NLRP1 NLRP1炎性小體由NLRP1受體、ASC和Pro-caspase-1組成，是NLRs家族成員之一，并且在腦組織中高度表達。NLRP1受體的特征在于5個結構域：N-末端PYD(吡林)結構域、NACHT(NAIP，CIITA，HET-E和TP1)結構域、LRRS、FIIND和C末端CARD域。當NLRP1受體激活時，FIND結構域被自動切割。Cao等[6]研究表明NLRP1是miR-9a-5p的靶基因，參與了NLRP1炎性小體介導缺血性損傷誘導的炎癥反應。miR-9a-5p過表達下調NLRP1；miR-9a-5p的過表達不僅降低了NLRP1、Asc和Pro-caspase-1的水平，同時降低了IL-1β和IL-18的水平，提示過表達miR-9a-5p可改善缺血性卒中后腦損傷。

2.2 NLRP3 NLRP3炎性小體是由NLRs家族成員之一的NLRP3受體、ASC及Pro-caspase-1組成。N末端PYD、中央NACHT和C末端LRR這3個結構域是NLRP3受體結構特征。N末端PYD結構域有利于與適配器蛋白ASC的下游雙配體PYD-PYD的偶聯。NACHT結構域調控NLRP1和NLRP3受體激活，一旦激活即引起寡聚并形成炎性小體的中心核心，這是一個ATP依賴的過程[7]。LRR結構域被認為與配體感知和自身調節有關[8]。Ma等[9]研究注射用丹酚酸可通過抑制NLRP3小膠質細胞炎性小體激活，促進小膠質細胞表型由M1向M2轉變，減少神經元凋亡，進而發揮神經保護作用。Yin等[10]研究證實TET2通過TUG1去甲基化和調節TUG1/miR-200A-3p/NLRP3通路參與了腦缺血再灌注誘導的炎癥反應。Sun等[11]發現低密度脂蛋白受體(LDLR)調節NLRP3介導的缺血性卒中后神經元焦亡和神經炎癥，提示LDLR在急性腦缺血損傷的神經炎性反應中可能是潛在的治療靶點。

NLRP3炎性小體的組裝和下游信號的激活依賴于兩個與細胞損傷相關的互補信號：其中一個啟動信號是通過核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated Pro-tein kinase,MAPK)信號通路實現的，上述通路可上調NLRP3炎性小體復合體蛋白和前體IL-1β和前體IL-18的表達[12]；另外一個互補信號可介導NLRP3激活和ASC磷酸化，從而觸發NLRP3炎性小體的組裝、caspase-1的活化以及Pro-IL-1β和Pro-IL-18的加工，最終引起 IL-1β和IL-18的分泌。

2.2.1 NLRP3炎性小體活化的啟動調控 在靜息狀態下，NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL-18在細胞中的表達量較低，無法直接組裝或活化NLRP3炎性小體，因此啟動信號，特別是NLRP3相關蛋白的上調是激活NLRP3炎性小體所必需的。Fann等[13]的研究發現靜脈注射免疫球蛋白制劑可以減少NF-κB和MAPK信號通路的激活，導致NLRP3炎性小體的表達和活化降低，表明NF-κB和MAPK信號通路在調節缺血條件下原代皮質神經元和腦組織中NLRP3炎性小體的表達和激活方面發揮著關鍵作用。

2.2.2 NLRP3炎性小體活化的激活調控 在激活啟動信號后，接頭蛋白ASC招募NLRP3蛋白，形成NLRP3炎性小體復合體。目前，NLRP3炎性小體有多種激活機制，包括K+外流、ROS過量產生、線粒體功能障礙、Ca2+超載和溶酶體破裂等。

在細胞內外因子中，K+外流在激活NLRP3炎性小體方面起著重要作用[14]。這種位于細胞表面的非選擇性K+陽離子通道能夠依賴三磷酸腺苷的結合改變細胞內的離子含量，激活下游信號，誘導IL-1β的成熟和分泌。研究表明，與其他已知刺激相比，下調細胞內K+水平對于激活NLRP3炎癥小體通路是必不可少的，突出K+外流在這一過程中的重要作用。嘌呤能離子通道型受體7(purinergic ligand-gated ion-channel 7receptor,P2X7R)是與K+外流相關的受體之一，其激活可能通過ATP誘導促炎細胞因子的釋放并放大缺血性損傷。Ye等[15]研究發現P2X7R、NLRP3炎性成分和裂解的caspase-3在卒中后缺血腦組織中的表達顯著增強。然而，在用 P2X7R 拮抗劑(BBG)或NLRP3抑制劑(MCC950)治療卒中后，裂解的caspase-3的表達顯著減弱，該治療顯著減少了腦組織梗死體積、神經元凋亡和神經損傷。

線粒體損傷是NLRP3炎性小體的另一個重要激活機制。線粒體是一個雙膜結合的細胞器，是細胞內產生能量和ROS的主要部位[16]。以往的研究表明，在多種細胞應激下，尤其是線粒體產生的高水平的ROS激活了NLRP3炎性小體信號通路[17]。大量的ROS誘導ROS清除劑硫氧還蛋白從硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)中分解出來，然后直接與NLRP3蛋白結合，并通過寡聚作用調節其組裝[18]。Ishrat 等[19]研究表明腦缺血發生后，腦組織中TXNIP表達增加，ROS能導致TXNIP和硫氧還蛋白1(thioredoxin,TRX1)解離后快速與NLRP3結合，誘導NLRP3炎性小體活化，抑制TXNIP使NLRP3炎性小體活化受阻，減輕缺血性腦損傷。功能障礙的線粒體還將線粒體DNA釋放到細胞質中，通過分子自結合直接誘導NLRP3炎性小體復合物的組裝[20]。

2.3 AIM2 AIM2炎性小體是一種細胞質傳感器，可以識別來自病毒、細菌或宿主本身的雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)。AIM2由PYD和HIN-200結構域組成，AIM2蛋白是AIM2炎性小體激活成分。Li等[21]研究發現胞漿DNA通過環磷酸腺苷合成酶和AIM2參與多種獨立但互補的DNA傳感信號，在缺血時協同發揮最大的炎癥反應。胞質雙鏈DNA的抑制劑A151顯著減少腦梗死體積，減輕神經缺陷，并減少細胞死亡，抑制整體神經炎性反應，并可能為缺血性卒中提供一種新的治療理念。Liang等[22]發現MEG3基因敲除可抑制氧糖剝奪/復氧誘導的細胞焦亡和炎癥反應。缺乏MEG3可抑制caspase-1信號轉導，降低AIM2、ASC、裂解的caspase-1和GSDMD-N的表達，提示MEG3/miR-485/AIM2軸在腦缺血再灌注過程中通過激活caspase-1信號通路參與細胞焦亡的發生，可能是缺血性卒中有效的治療靶點。

2.4 NLRC4 NLRC4又被稱為IPAF(IL-1β converting enzyme protease activating factor，IL-1β轉換酶蛋白激活因子)，為NLR家族成員之一。NLRC4受體的特征在于3個結構域：其N端為caspase募集結構域(caspase recruitment domain，CARD)，是效應結構域，可募集并活化Pro-caspase-1，負責下游信號轉導；中間為NACHT結構域，是NLR家族成員共有的特征性結構域，自N端至C端依次為NBD-HD1-WHD-HD2，它能介導NLR分子的寡聚并改變其構型；C端為亮氨酸重復結構域(leucin rich repeat，LRRs)，負責PAMP等配體的識別和結合。近年來研究表明，炎性小體激活可導致神經元和神經膠質細胞死亡，進而導致缺血性腦卒中后腦部損傷和神經系統損害。Wang等[23]研究表明在高糖缺氧/復氧(H/R)誘導的小膠質細胞中，敲除長鏈非編碼RNA-Fendrr(LncRNA-Fendrr)基因后，NLRC4和炎性細胞因子減少。LncRNA-Fendrr可通過E3泛素連接酶HERC2保護NLRC4蛋白的泛素化和降解，從而加速小膠質細胞的焦亡。

3 炎性小體參與腦缺血誘導的細胞損傷

3.1 炎性小體與細胞凋亡 細胞凋亡是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用。經典凋亡的激活主要通過兩條途徑發生。一種是外源性途徑，通過激活細胞表面的凋亡受體激活，最終激活caspase-8或caspase-10；另一種是內源性途徑，也稱為線粒體凋亡途徑，起始于線粒體細胞色素C并激活caspase-9。這兩種途徑都會導致信號轉導級聯反應，最終通過激活caspase-3導致細胞凋亡。以往的研究表明，腦缺血再灌注產生的自由基主要由線粒體釋放，導致神經元的氧化應激。線粒體中活性氧的過量產生可損傷線粒體和脂質，從而損害線粒體功能并導致通透性增加。通透性增高的線粒體釋放細胞色素C，激活caspase并導致腦缺血再灌注后的細胞死亡。Kang等[24]沉默TRIM22基因抑制NF-κB/NLRP3的激活，抑制神經炎癥和細胞凋亡，表明TRIM22可能是治療腦I/R損傷的潛在靶點。

3.2 炎性小體與細胞自噬 在自噬過程中，細胞內形成自噬囊泡，將自身的蛋白質或細胞器包裹，然后與溶酶體融合并對其降解。NLRP3炎性小體與自噬之間存在著密切關系。一方面，NLRP3炎性小體的激活可以調節自噬的誘導；另一方面，自噬可以控制炎性小體的激活及其活性。它們共同調節宿主防御、炎癥反應及預防過度炎癥間的平衡，并形成了必需的正負反饋循環。caspase-1的激活可抑制自噬誘導，激活炎癥反應，這是清除病原體所必需的。然而，過度的炎癥反應可以導致器官和組織損傷以及誘發炎性疾病。自噬可以通過清除NLRP3炎性小體激活物和炎性成分抑制炎癥反應。Wang等[25]發現抑制GSK-3β可通過增強腦缺血再灌注損傷中的自噬活性而下調NLRP3表達水平，提示GSK-3β可能是其特異性靶點。He等[26]發現腦缺血再灌注損傷激活NLRP3炎性小體，提高caspase-1、IL-1β和IL-18水平，自噬活性增強。白藜蘆醇是一種特異性NAD-依賴性去乙酰化酶Sirtuin-1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，Sirt1)激動劑，白藜蘆醇治療明顯減少了腦梗死體積和腦含水量，并改善神經學評分。側腦室注射3-MA抑制自噬可阻斷白藜蘆醇對NLRP3炎性小體激活的抑制作用。敲低Sirt1顯著阻斷白藜蘆醇誘導的自噬活性和對NLRP3炎性小體激活的抑制，上調自噬，提示白藜蘆醇通過抑制Sirt1依賴的自噬活性來抑制NLRP3炎性小體的激活，從而對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

3.3 炎性小體與細胞焦亡 細胞焦亡是一種程序性細胞死亡，其發生途徑主要為兩條途徑。caspase-1的經典細胞焦亡途徑為NLR家族的pyrin結構域通過識別同源配體與ASC結合，而后結合并活化caspase-1的前體，形成具有活性的caspase-1。活化的caspase-1將GSDMD裂解為22 kDa的C端片段和31 kDa的N端片段，GSDMD-N的產生直接誘導了細胞膜穿孔、破裂，細胞內容物釋放引發炎癥反應。同時活化的IL-1β和IL-18蛋白通過細胞膜上的氣孔被釋放到細胞外[27]。在以革蘭陰性菌表面內毒素(lipopolysaccharide，LPS)為代表的各種感染因素的刺激下，細胞焦亡非經典途徑將被活化。caspase-11被證明能作為天然受體與LPS結合，LPS可以胞吞形式進入細胞與caspase-11前體結合并將其活化，活性的IL-1β和IL-18等內容物隨著細胞膜的破裂、穿孔而釋放引發炎癥反應。同時，GSDMD的N端片段通過典型途徑激活NLRP3，進而誘導細胞焦亡[28]。Li等[29]發現吲哚布芬或阿司匹林預處理聯合氯吡格雷或替格瑞洛可通過抑制NF-κB/NLRP3信號通路，減輕大鼠腦缺血再灌注和PC12細胞氧糖剝奪/復氧炎性小體介導的細胞焦亡。Fann等[13]的研究表明，腦缺血再灌注損傷發生時，外周炎性細胞透過血腦屏障與中樞系統活化的小膠質細胞均可釋放等IL-18、IL-1β促炎性細胞因子，引起焦亡相關蛋白高表達，導致廣泛的膠質細胞和神經元細胞死亡，表明細胞焦亡在腦缺血再灌注損傷過程中發揮重要作用，抑制NLRP3炎性小體表達可以同時抑制下游焦亡途徑相關蛋白的表達，限制炎癥反應并減輕腦缺血再灌注損傷，針對神經元炎性小體激活的治療干預可能為未來缺血性卒中的治療提供新的機會。

4 結語和展望

綜上所述，缺血性腦卒中是一個多因素參與的病理生理過程，其發病機制較為復雜。對其病理生理學機制的深入研究將為該疾病的防治提供新的靶點。炎癥反應作為一種組織損傷的先天免疫反應，在急性損傷性疾病如缺血性腦卒中發生時首先被激發，其過程中炎性小體發揮著重要的作用。目前為止，已發現二十余種炎性小體[30]，其在缺血性腦卒中發生后病變部位表達異常，表明炎性小體是缺血性腦卒中發生發展的重要組成部分。雖然很多研究者在動物實驗研究上顯示通過基因敲除及基因沉默等技術，能有效地調控炎性小體的活性，對缺血性腦卒中起到一定的神經保護作用，然而其研究仍需深入。因此，針對炎性小體信號上游和下游的多個潛在靶點的研究，如何通過干預炎癥小體的表達、組裝、活性及其產物來有效調控神經炎癥、自噬、細胞凋亡等，并發現及挖掘有效的干預靶點，可能為該疾病的防治提供新的思路。