核因子E2相關因子2與腦梗死的相關研究

吳飛躍 朱丹

生命體中，適量自由基與活性氧（ROS）、活性氮（RNS）物種在細胞信號傳導中作為調節介質發揮著重要作用[1]。當產生和消除不平衡時可引起氧化應激，通過炎癥、凋亡和細胞壞死、血腦屏障（BBB）破壞等機制導致重要生物分子和細胞損傷，參與腦血管疾病、神經系統變性疾病、癌癥及衰老等病理過程的發生。核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種轉錄因子，通過結合并激活含有抗氧化反應元件（ARE）啟動子的表達，參與機體的抗氧化過程，維持細胞穩態。

腦卒中是60歲以上人群第二常見死亡原因，其中缺血性卒中的占比最高，是永久性殘疾的最常見原因[2]。急性卒中治療的主要目的是挽救缺血半暗帶。隨著靜脈溶栓治療以及血管內血栓清除術的開展，急性缺血性卒中患者的治療獲得了顯著成效。但由于溶栓治療有限的治療時間窗和潛在的副作用，少數患者能從中受益，因此需要研究新的治療方法。缺血半暗帶細胞死亡的幾個關鍵因素已被確定，包括興奮毒性、氧化和亞硝化應激以及炎癥。Nrf2的激活是通過轉錄上調Ⅱ期防御酶和抗氧化應激蛋白，在細胞防御氧化應激中起關鍵作用。大腦保護自己免受有害刺激并從缺血性損傷中恢復的內源性防御機制是中風研究的一個關鍵目標[3]。本綜述將討論Nrf2-Keap1抗氧化反應元件轉錄途徑在神經保護中的可能作用以及探討這種途徑的激活是否能保護大腦免受BBB破壞。近年來，相關藥物的研究使Nrf2有望成為藥理學靶點，現回顧總結Nrf2在生理和病理條件下的作用及相關藥物的研究現狀，探討其與當前潛在治療策略的相關性。

1 活性氧與氧化應激

自由基和ROS、RNS物種起著雙重作用，在生物體內以可控的方式產生。作為細胞信號傳導的重要組成部分，通過轉錄因子、代謝酶和膜通道等的激活或失活來調節多種細胞功能[4]。當產生和消除不能達到平衡時導致氧化損傷和組織功能障礙[5]。 RNS是一種能夠破壞生物分子的強氧化劑，與ROS一樣，RNS起著雙重作用，它們對生命系統既可能有害，也可能有益[6]。ROS和RNS被復雜的抗氧化系統平衡，以維持細胞中的氧化還原穩態[5]。

2 Keap1-Nrf2-ARE通路的組成和作用

2.1 Nrf2Nrf2是細胞氧化還原穩態的主要調節因子，具有高度保守的堿性區亮氨酸拉鏈結構，是結合轉錄復合物的重要組成部分，控制一系列編碼解毒酶和抗氧化蛋白基因的表達[6]。Nrf2靶基因由抗氧化酶、參與異生素解毒的蛋白質、參與修復及去除的蛋白質、炎癥抑制因子以及其他轉錄因子的大網絡組成[7]。與谷胱甘肽（GSH）的合成、利用和再生，NADPH以及血紅素加氧酶-1（HO-1）的產生相關[5]，還介導細胞保護酶及蛋白質對親電和氧化攻擊的上調，成為細胞抗氧化的主要調節因子[4]。Nrf2蛋白包含605個氨基酸，形成6個功能域，命名為Neh1～6。Neh1為異二聚化結構域，Nrf2通過該結構域與其轉錄伴侶小Mafs相互作用，作為異二聚體結合到DNA上[8]。Neh2為Nrf2的負調控結構域。Neh3與染色體ATPase解旋酶DNA結合蛋白CHD6結合，作為轉錄輔激活因子促進抗氧化反應元件（ARE）依賴基因的轉錄。Neh4和Neh5結構域協同作用，結合另一個轉錄輔激活因子CBP。Neh6結構域控制非Keap1依賴性負調節[9]。在正常條件下Nrf2定位在細胞質中，與肌動蛋白結合蛋白Keap1相互作用，并被泛素-蛋白酶體途徑快速降解。來自活性氧或親電損傷的信號使Nrf2與Keap1解離，穩定的Nrf2轉移到細胞核并反式激活其靶基因，進一步參與機體的抗氧化過程[10]。

2.2 Keap1Keap1是Nrf2的負調節因子，廣泛表達并存在于細胞質中，是感知內源性氧化和親電應激的中樞，在Nrf2的調節中起關鍵作用[11]。Keap1由624個氨基酸的蛋白質組成，包含3個主要結構域:BTB二聚化結構域、富含半胱氨酸的IVR結構域和C端Kech樣結構域[9]。Keap1包含兩個已知的蛋白質相互作用結構域:N末端區域的BTB結構域介導Keap1與Cullin3的結合，C末端區域的雙甘氨酸重復序列（DGR）結構域介導Keap1與Nrf2 Neh2的結合，共同參與催化Neh2結構域賴氨酸殘基上Nrf2蛋白的多泛素化[5]。Keap1與Nrf2的關聯依賴于蛋白Keap1半胱氨酸殘基的活性巰基。興奮劑（如親電試劑和氧化劑）可以修飾這些半胱氨酸殘基，導致Nrf2從Keap1上解離。在基礎條件下，Nrf2被二聚體Keap1/Cullin3復合物錨定在胞質溶膠中，Keap1通過直接結合到N端Neh2結構域來抑制Nrf2活性。Keap1與Neh2的相互作用導致Nrf2在細胞質中隔離，并通過蛋白酶體增強Nrf2的降解，從而對反應進行嚴格調節[5]。親電物種水平的增加導致BTB和IVR結構域中半胱氨酸殘基的共價修飾，并促使Cullin3解離和其他構象變化，使Nrf2從Keap1上解離，從而增加了Nrf2的穩定性，并進一步促進Nrf2轉移到細胞核中。Nrf2與ARE序列在細胞核中結合，啟動細胞保護基因的轉錄[8]。這些共價修飾Keap1半胱氨酸殘基的幾個親電子小分子顯示出臨床前景[4]。

2.3 ARE保護基因的轉錄激活是由ARE的順式作用元件介導的。Nrf2與ARE結合，該通路控制基因表達，該基因的蛋白質產物通過偶聯反應和增強細胞抗氧化能力參與解毒和消除反應性氧化劑和親電試劑，從而保護細胞免受氧化應激誘導的細胞死亡[12]。ROS和親電物質水平升高和/或抗氧化能力降低而導致的細胞氧化還原狀態的改變與ARE介導的轉錄反應有關。除了參與誘導型基因表達，ARE還參與控制組成型基因表達，意味著增強子在應激和非應激條件下起維持細胞氧化還原穩態的關鍵作用[11]。

3 線粒體在氧化應激中的作用

3.1 Nrf2與線粒體的直接作用線粒體在生物合成和凋亡中起重要作用，還與其他ROS細胞間存在相互作用。Nrf2通過提供還原型谷胱甘肽（GSH）參與維持線粒體氧化還原穩態，此外還通過線粒體蛋白（如DJ-1、PGAM5和frataxin）對Nrf2活性進行調節。在Nrf2和線粒體之間形成了一個相互調節的環[6]。在對Nrf2敲除小鼠分離的線粒體的實驗觀察表明，Nrf2在維持線粒體膜完整性方面的作用可能涉及線粒體膜通透性的轉變。Nrf2敲除細胞表現出自發凋亡增加，對化學誘導的線粒體損傷高度敏感，而化學保護劑激活Nrf2可防止線粒體損 傷[5]。Nrf2的過表達阻止H2O2誘導的線粒體網絡的破壞、線粒體膜電位的喪失。Nrf2定位于線粒體外膜表明Nrf2與線粒體組分直接相互作用以保持線粒體的完整性和功能。研究表明Nrf2與線粒體調節呈正相關，Nrf2線粒體保護激活劑的開發有望保護神經元細胞免受氧化損傷和神經變性[11]。

3.2 Nrf2影響干細胞的功能Nrf2也影響干細胞的線粒體功能，對干細胞自我更新、存活有影響。Nrf2活性狀態影響線粒體生理學包括生物發生、脂肪酸氧化、呼吸、ATP產生、氧化還原穩態以及結構完整性和動力學[13]。許多人類病理狀態和衰老與線粒體功能障礙有關的同時也被證實與抑制的Nrf2信號相關。干細胞內的細胞氧化還原平衡可調節細胞再生的過程。當暴露于氧化應激時，Nrf2敲除干細胞的自發凋亡率增加，存活率降低。表明Nrf2在造血和干細胞存活中起關鍵作用[6]。

4 Nrf2與BBB的保護作用

BBB能選擇性限制血源性和外源性物質進入中樞神經系統，從而保持大腦穩態[14]。其完整性是由氧化應激調節的[15]。腦血管內皮非常容易受到氧化應激的影響。Nrf2能表達一種調節內皮功能的氧化還原敏感轉錄因子，在調節緊密連接完整性和維持BBB功能中起著潛在作用。Nrf2缺失或下調導致應激水平的增加將對緊密連接和粘附連接蛋白的表達產生負面影響，細胞間緊密連接復合物的組成改變是潛在的機制之一，這種機制可能損害BBB功能，并導致內皮屏障阻力降低，進而導致BBB功能障礙。Nrf2信號的持續激活可能有預防低血糖誘導的腦血管功能障礙的潛力，通過戊糖磷酸途徑重新引導代謝流量，從而對細胞生物能學和新陳代謝起到關鍵的調節作用。BBB內皮獨特的結構和功能表型需要高能量，具有豐富的葡萄糖轉運蛋白和線粒體，Nrf2介導的葡萄糖攝取調節可能對BBB的功能和完整性至關重要。BBB的完整性對確保最佳的中樞神經系統功能至關重要，其在腦血管病理過程中的破壞可能是主要神經系統疾病發生和進展的先兆[16]。

5 Nrf2相關藥物的治療進展

5.1 Nrf2相關臨床前藥物的治療進展近年來，多種植物提取物被證明與Nrf2防御途徑的激活相關：①獐牙菜苦苷（Swe）是從秦艽中分離得到的一種活性裂環烯醚萜苷類化合物。實驗研究證明Swe預處理促進了Keap1-Nrf2復合物的Nrf2核易位，并增強了NAD（P）H:醌氧化還原酶-1（NQO1）和HO-1在體內外的表達，被認為是通過激活Nrf2途徑保護腦缺血再灌注損傷有前途的保護劑[17]。②根皮素屬于類黃酮家族，在蘋果和蘋果衍生產品中含量高。大量證據表明根皮素具有抗氧化特性，其機制與氧化應激抑制和Nrf2防御途徑激活有關。根皮素預處理后Nrf2表達顯著增加，上調缺血/再灌注腦組織中Nrf2 mRNA和蛋白的表達，顯著抑制了氧化應激過程[18]。這表明根皮素有利于治療與氧化應激相關的缺血性卒中。③青藤堿作為一種從青藤莖和根中分離出來的生物堿，具有抗炎和免疫調節等廣泛作用。通過泛素化蛋白酶體介導的Keap1降解激活Nrf2信號通路[19]。青藤堿不僅被發現通過調節離子通道對缺血性腦損傷發揮保護作用，還發現通過抑制小膠質細胞對腦出血誘導的腦損傷起保護作用。實驗證明青藤堿可在中樞神經系統組織中獲得，可通過BBB[17]。因此認為青藤堿具有治療中樞神經系統疾病的巨大潛力。

5.2 Nrf2相關臨床藥物的治療進展此外，許多臨床藥物也顯示出較好的治療前景。研究發現丹紅注射液可以提高抗氧化酶SOD 和GPX 的表達水平，可以通過調控Nrf2信號通路改善干細胞移植微環境，增加移植干細胞的存活率[20]。另外，也有研究證明在缺血紋狀體和皮質中，人參或富馬酸二甲酯（DMF）預處理以Nrf2依賴的方式減輕星形膠質細胞和小膠質細胞反應性膠質增生，并通過Nrf2依賴機制對缺血性腦損傷產生持久的神經保護作用[21]。 五味子提取物被證明可以顯著上調Nrf2，促進Nrf2從細胞質向細胞核的移位，還可抑制Keap1的表達，并顯著增加Nrf2的穩定性。敲除Nrf2可減弱五味子提取物對這些藥物代謝酶和藥物轉運蛋白的調節作用[22]。此外，李艷紅等[23]發現腺苷蛋氨酸聯合糖皮質激素可通過激活Nrf2/Ho-1通路發揮抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等作用， 從而減輕細胞損傷。實驗數據顯示血栓通注射液可通過激活Nrf2-VEGF通路顯著增加了Nrf2、HO-1和NQO1的表達，促進血管生成，可明顯改善神經元功能缺損[24]。研究還發現三七總皂苷和人參皂甙Rb1通過激活Nrf2，抑制p38-VCAM-1信號通路可以促進Nrf2蛋白的核易位，從而抑制血管粘附事件[25]。體外實驗數據證實，銀杏內酯通過激活Akt/Nrf2通路可顯著降低ROS水平，提高SOD活性和HO-1和NQO1蛋白水平。在體內可顯著降低大腦中動脈閉塞大鼠模型的梗死體積比，且呈劑量依賴性，還顯著上調HO-1、NQO1、SOD、p-Akt、p-Nrf2和Nrf2的蛋白水平，顯著抑制腦缺血再灌注引起的氧化應激損傷[26]。越來越多藥物不斷顯示出神經保護作用，對該類藥物內源性保護機制的不斷深入研究可為神經系統疾病的治療提供新的途徑。

6 小結

Nrf2是抗氧化的主要調節劑，Nrf2抗氧化特性對多種疾病表現出多重保護作用，為藥物的開發開辟了新途徑。然而，基于目前對急性腦梗死損傷和修復過程的認識不完善，需要進一步的研究來建立“治療窗”，以明確Nrf2的激活在腦卒中發作前后如何提供腦保護。了解Nrf2介導的氧化還原信號的分子機制，可以為神經保護的潛在治療提供依據。BBB損傷是缺血性腦損傷的一個關鍵病理過程，也是重癥腦卒中和溶栓治療誘發出血的潛在因素。因此，保護BBB是一個重要的治療靶點，它不僅可以降低溶栓過程中的出血風險，還可以改善重癥腦卒中的預后。進一步了解Nrf2在卒中發生后BBB保護中的具體作用及相關機制將為探索缺血性卒中的有效和安全的治療方法提供思路。