硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內藥物代謝動力學研究

劉雪松，陳 亮，馮萬宇，張 蕾，沈思思，蘭世捷，李 丹，苗 艷，黃寶銀，史同瑞

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

硫酸頭孢喹肟(Cefquinome sulfate)，分子式為C23H24N6O5S2H2SO4，CAS號為118443-89-3，又稱為硫酸頭孢喹諾和硫酸頭孢喹咪。硫酸頭孢喹肟是動物專用第4代頭孢菌素類藥物，相比較于前3代頭孢菌素類藥物，具有更廣的抗菌譜，更強的抗菌效果，以及對β-內酰胺酶具有更高的穩定性[1]。硫酸頭孢喹肟優良的抗菌活性與其化學結構有著極大的關系。硫酸頭孢喹肟帶一個正電荷的四價季銨離子基團，而母核帶負電荷，這種結果與前3代頭孢菌素的結構不同。這一結構可以幫助硫酸頭孢喹肟迅速穿過細胞膜，并且保證了其對β-內酰胺酶的高度穩定性[2]。許多報道表明，硫酸頭孢喹肟對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、致病性大腸桿菌以及多殺性巴氏桿菌等具有良好的敏感性。對治療細菌引起的敗血癥、乳房炎以及子宮內膜炎等具有良好的效果[3]。硫酸頭孢喹肟在多種動物上進行過藥物代謝動力學研究，但是在安格斯牛體內的藥物代謝動力學研究未見報道。試驗為首次在安格斯牛體內進行的硫酸頭孢喹肟藥物代謝動力學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 硫酸頭孢喹肟注射液，批號：DLD210401，購自河北遠征藥業有限公司。硫酸頭孢喹肟標準品，批號：G130285，購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。色譜級乙腈，批號：R141437，購自北京迪科馬科技有限公司。分析級甲酸，批號：20171018，購自遼寧泉瑞試劑有限公司。

1.1.2 儀器 島津LC 20-AT液相色譜儀、二級陣列管檢測器、InertSustainC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，購自日本島津公司。TGL-16G高速離心機，購自上海安亭科學儀器廠。MD200-1氮吹儀，購自杭州奧盛儀器有限公司。渦旋振蕩器，購自海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.1.3 試驗動物 安格斯牛6頭，170～220 kg，雌性各半，7～8月齡，購自黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛養殖廠。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 根據相應參考文獻，確定流動相為0.05%甲酸水和乙腈，體積比為90∶10。流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為270 nm[4]。

1.2.2 樣品前處理 將300 μL血漿，加入300 μL的1%甲酸乙腈，混合均勻后，用渦旋震蕩1 min后，14000 r/min離心15 min，吸取上清，進行氮氣吹干，溫度為60 ℃。用300 μL流動相對吹干物質進行溶解，過膜后上機檢測。

1.2.3 繪制標準曲線 對不含有任何藥物的安格斯牛血漿進行處理，獲得不含有任何藥物的血漿基質，在80 μL無藥物的血漿基質中添加20 μL相應濃度的硫酸頭孢喹肟標準品溶液，均勻混合，使最終藥物濃度分別為5、10、50、200、500、1000 ng/mL。分別將添加藥物的樣品進行高效液相色譜檢測，繪制標準曲線。

1.2.4 方法學專屬性 向80 μL不含有任何藥物的血漿中添加20 μL相應濃度的硫酸頭孢喹肟的標準液，使得藥物最終濃度分別為50、500、1000 ng/mL。進行前處理后進行高效液相色譜藥物濃度檢測。將經過前處理的藥物峰面積與標準曲線中的藥物峰面積進行比較。做3個重復，3個批次，計算回收率、批內相對標準差以及批間相對標準差。根據信噪比S/N≥3時添加到無藥血漿基質中的硫酸頭孢喹肟的濃度作為檢測限(LOD)，S/N≥10時添加到無藥血漿基質中的硫酸頭孢喹肟的濃度為定量限(LOQ)。

1.2.5 藥動學設計 在給藥開始前，采集未注射任何藥物的安格斯牛血液，置于肝素鈉無菌采血管中。經過離心后，獲得無藥物的空白血漿。將6頭牛分為A、B兩組。其中A組以2 mg/kg的劑量靜脈注射硫酸頭孢喹肟，B組以2 mg/kg的劑量皮下注射硫酸頭孢喹肟。在給藥后，兩組牛在0.083、0.167、0.5、1、3、6、9、12 h進行頸靜脈采血。靜脈注射的牛在注射藥物的對側頸靜脈采血。采血量為4 mL，置于含有肝素鈉的無菌采血管中。采集的血液樣品在3500 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清，獲得血漿樣品。6頭牛在經過2周的休藥期后，隨機選取3頭牛以2 mg/kg的劑量進行肌肉注射，并按上述操作進行血漿樣品的獲取。

1.2.6 參數計算 藥動學數據采用Winnonlin 5.2.1軟件進行分析。采用非房室模型(Non-compartmental analysis,NCA)分析血漿中藥物濃度-時間數據。計算肌肉注射的絕對生物利用度，以及皮下注射的絕對生物利用度，公式如下。

2 結果與分析

2.1 方法學專屬性 硫酸頭孢喹肟的出峰時間為16.8～17.2 min。在硫酸頭孢喹肟標準品、硫酸頭孢喹肟血漿添加樣品以及采集的血漿樣品中都無雜質峰干擾。無藥物血漿色譜圖、硫酸頭孢喹肟標準品色譜圖以及采集的血漿樣品色譜圖如圖1所示。

a. 無藥物血漿色譜圖；b. 硫酸頭孢喹肟標準品色譜圖；c. 給藥后采集血漿樣品色譜圖a. chromatogram of durg-free plasma sample; b. chromatogram of standard cefquinome sulfate sample. c. chromatogram of collected plasma sample after administration.圖1 樣品色譜圖Fig 1 Chromatograms of cefquinome sulate

在50、500、1000 ng/mL的濃度下，硫酸頭孢喹肟的回收率在82.35%～104.27%。批內相對標準偏差在1.73%～6.87%，批間相對標準偏差在3.69%～8.75%。根據信噪比S/N≥3時添加到無藥血漿基質中的硫酸頭孢喹肟的濃度，檢測限(LOD)為10 ng/mL，根據信噪比S/N≥10時添加到無藥血漿基質中的硫酸頭孢喹肟的濃度，定量限(LOQ)為20 ng/mL。試驗采用的高效液相色譜方法具有良好的方法學專屬性。

2.2 標準曲線 標準曲線如圖2所示，相關系數為0.9974，方程為Y=12960X+110486。說明標準曲線線性關系良好，標準曲線可用。

圖2 標準曲線圖Fig 2 Standard curve

2.3 藥代動力學參數計算 藥物-時間數據如表1所示。藥物代謝動力學參數如表2及圖3所示。具體藥-時數據如表3所示。靜脈注射后硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的藥物代謝動力學參數如下：消除半衰期(T1/2β)為(2.05±0.49) h，達峰時間(Tmax)為(0.75±0.25) h，藥時曲線下面積(AUC)為(24.72±5.31) μg·h/mL，達峰濃度(Cmax)為(7.31±1.98)μg/mL，平均滯留時間(MRT)為(2.83±0.61)h，清除率(CL)為(0.07±0.02)L/h·kg，表觀分布容積(Vd)為(0.23±0.06)L/kg。肌肉注射后硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的藥物代謝動力學參數如下：消除半衰期(T1/2β)為(2.17±0.51)h，達峰時間(Tmax)為(0.87±0.25)h，藥時曲線下面積(AUC)為(19.97±3.11)μg·h/mL，達峰濃度(Cmax)為(5.34±1.21)μg/mL，平均滯留時間(MRT)為(3.02±0.71) h，清除率(CL)為(0.09±0.03) L/h·mLkg，表觀分布容積(Vd)為(0.31±0.08)L/kg。皮下注射后硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的藥物代謝動力學參數如下；消除半衰期(T1/2β)為(2.37±0.47) h，達峰時間(Tmax)為(1±0.37) h，藥時曲線下面積(AUC)為(20.51±4.87) μg·mLh/mL，達峰濃度(Cmax)為(5.16±1.29) μg/mL，平均滯留時間(MRT)為(3.26±0.89) h，清除率(CL)為(0.09±0.04) L/h.kg，表觀容積(Vd)為(0.32±0.09) L/kg。肌肉注射的絕對生物利用度(F)為80.78%。肌肉注射的絕對生物利用度(F)為82.96%。

表1 藥-時數據Tab 1 Concentration-time data

表2 藥動學參數Tab 2 Pharmacokinetic parameters

圖3 藥-時曲線圖Fig 3 Concentration-time curve

3 討論與結論

硫酸頭孢喹肟的藥物代謝動力學研究在多種動物上都有相關的報道。本次靜脈注射后的消除半衰期(T1/2β)為2.05 h，與Ahmad在牛體內測定的2.1 h接近[5]，低于Dinakaran等在水牛體內測定的3.56 h[6]，低于Dumka等在山羊體內測定的5.76 h[7]，高于Cheng等在雛鴨體內測定的0.97 h，以及在雛鵝體內測定的1.73 h[8]。本次靜脈注射后，硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的表觀分布容積(Vd)為0.23 L/kg，略低于Ahmad在牛體內測定的0.28 L/kg[5]，低于宋永強在山羊體內測定的0.61 L/kg[9]，低于Cheng等在雛鵝體內測定的0.43 L/kg，高于在雛鴨體內測定的0.042 L/kg[8]。測得的血漿清除率(CL)為0.07 L/h·mLkg，與Dinakaran在水牛體內測定的0.06 L/h·mLkg相近[6]，低于Ahmad在牛體內的0.12 L/h·mLkg以及Zhao等在黑天鵝體內測定的0.13 L/h·mLkg[5,10]。靜脈注射后的藥時曲線下面積(AUC)為24.72 μg·h/mL，低于Dumka在山羊體內測定的33.83 μg·h/mL，高于Zhou等在比格犬體內測定的8.51 μg·h/mL[7,11]。測定的靜脈注射后在安格斯牛體內的平均滯留時間(MRT)為2.83 h，低于Dinakaran在水牛體內測定的4.24 h[6]，低于Dumka在山羊體內測定的6.09 h[7]，高于Ahmad在牛體內測定的2.3 h[5]。研究中肌肉注射后的消除半衰期(T1/2β)為2.17 h，高于李沖在豬體內測定的1.98 h[12]，低于Dumka在山羊體內測定的5.86 h[7]，低于俞吉杰在肉鴨體內測定的5.76 h[13]。測定肌肉注射后，硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的表觀分布容積(Vd)為0.31 L/kg，與Zhao等測定的靜脈注射后在黑天鵝體內的0.32 L/kg相近，低于李沖在豬體內測定的0.71 L/kg[10,12]。肌肉注射后，硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的達峰濃度(Cmax)為5.34 μg/mL，與Zhang等在黑天鵝體內測定的5.71 μg/mL相近[10]，高于Dumka等在山羊體內測定的4.84 μg/mL[7]，高于Zhou在比格犬體內測定的4.84 μg/mL[11]。本次試驗，肌肉注射的絕對生物利用度(F)達到了80.78%，高于Dumka等在山羊體內測定的57.39%[7]，高于Zhao在黑天鵝體內測定的74.2%[10]，低于Zhou等在比格犬體內測定的97.8%[11]。皮下注射后測定消除半衰期(T1/2β)為2.37 h，低于Corum等在綿羊體內測定的7.59 h[14]。達峰濃度(Cmax)為5.16 μg/mL，高于Zhou等在比格犬體內測定的3.88 μg/mL以及Corum等在綿羊體內測定的3.65 μg/mL[11,14]。根據歐盟藥敏試驗(EUCAST)標準的規定，流行病學折點值(Epidemiological cut-off，ECOFF)是協助藥物臨床使用折點制定的重要依據之一[15]。目前為止，根據EUCAST官網上已經公布的數據，頭孢喹肟對于溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)的ECOFF值為0.06 μg/mL。頭孢喹肟對于多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)的ECOFF值為0.125 μg/mL。頭孢喹肟對于275株大腸桿菌(Escherichiacoli)的MIC值皆為0.06 μg/mL。本次試驗，無論哪種注射方式，安格斯牛血藥濃度高于不同細菌ECOFF值的時間占比都較高，表明在現階段頭孢喹肟可以有效治療相關疾病。

以往的研究認為，硫酸頭孢喹肟的抗菌機制與其他頭孢菌素類抗生素一樣，都是通過競爭青霉素結合蛋白(Penicillin binding proteins，PBPs)抑制細菌細胞壁的形成，導致細菌死亡[16]。一些研究表明，除了以上的抗菌機制以外，頭孢喹肟也可以干預細菌生物被膜的形成，從而減少細菌極端抗性的產生。生物被膜(Biofilm)附著在生物或者非生物表面上，是由細菌及其分泌的多種基質組成的細菌群落，是造成致病性細菌持續感染的重要原因之一，是維持細菌毒力及其耐藥性的重要因素之一[17]。Zhou等建立了金黃色葡萄球菌生物被膜小鼠體內感染模型，并運用PK/PD同步模型得出了頭孢喹肟達到不同生物被膜減少效果的所需的PK/PD指數值，得出頭孢喹肟可以有效減少金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[18]。周永輝證明了低于最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)的頭孢喹肟可以對木糖葡萄球菌生物被膜的形成起到干預作用。低于MIC的頭孢喹肟可以降低咪唑甘油磷酸酯脫水酶(IGPD)的活性及組氨酸的生物合成，而且還可以與IGPD的組氨酸36、組氨酸63相結合，達到干預生物被膜的作用[19]。

除了經常使用的注射劑和粉針劑以外，許多新的硫酸頭孢喹肟劑型被研制出來。杜新旋[20]研制出了納米化硫酸頭孢喹肟透皮劑，提高了硫酸頭孢喹肟的滲透性，更加易于吸收，可以更加有效地在靶部位干預細菌生物被膜的形成，達到優良的抗菌效果。李德謙[21]研制出了硫酸頭孢喹肟的長效注射劑型，具有良好的緩釋作用，可以長效地抑制細菌生物被膜的形成。付強[22]研制出了硫酸頭孢喹肟的脂質體制劑，有效提高了硫酸頭孢喹肟的緩釋作用，抗菌有效性以及肺靶向性。李輝[23]研制成功了硫酸頭孢喹肟的乳膏劑，使硫酸頭孢喹肟給藥方式較為方便[23]。除此之外，乳房注入劑、微球以及微乳等劑型也已經研制成功。這些新劑型各具優勢，可以有效提高硫酸頭孢喹肟的利用率，并且可以有效提升硫酸頭孢喹肟在靶部位對于細菌生物被膜形成的干預作用。目前，作為動物專用的頭孢菌素類藥物，硫酸頭孢喹肟在臨床上使用率較高。試驗得出了硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內的藥動學參數，為硫酸頭孢喹肟在安格斯牛的合理使用提供了數據，也為減少細菌對硫酸頭孢喹肟的耐藥性提供了試驗依據。