減抗養殖條件下益生菌在畜禽養殖業中的應用

侯玉鳳,寧 揚，陳曉雯，韓澤朝，蔡巧利，陳甜甜，謝全喜，徐海燕

(山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態制劑重點實驗室，山東泰安 271000)

當今世界，各類疫病肆虐，給畜禽養殖業帶來了巨大的經濟損失。抗生素對各類疫病的治療發揮了積極作用，但是抗生素的大量使用加劇了畜禽養殖環境中抗生素抗性基因的積累，使其對病原微生物的抗藥性增加，不僅如此，抗生素的大量使用使得畜禽產品中藥物殘留增加，嚴重威脅人類健康。面對抗生素濫用的危害，抗生素替代產品的研究與應用引起了廣大研究者的重視，尋找抗生素替代產品也成為行業發展的必然需求。益生菌是當足量補充時對宿主健康有益的、活的微生物。益生菌能夠產生有助于動物消化吸收的酶來促進動物機體生長和保護動物機體健康，可作為飼料替抗添加物，在養殖業生產中具有重要意義。使用益生菌可增強動物的免疫力，減少使用抗生素，可達到健康養殖、生產健康食品的目標。在當前提倡減抗養殖的形勢下，益生菌作為一種新型、綠色、無耐藥性的產品，在世界畜禽養殖業禁抗大潮中越來越受到重視。

結合諸多研究者的研究進展對益生菌的作用機制及在畜禽養殖業中的應用進行了闡述，以期為益生菌的推廣應用提供參考資料。

1 益生菌的作用機制

研究表明，益生菌不僅在促進腸道蠕動、維持腸道穩態，抑制有害病原體，維持宿主腸道菌群的生態平衡中發揮作用，也能改善免疫反應，對抗各種病原體(細菌和病毒)感染[1-5]。

益生菌的抗菌、抗病毒活性主要與以下三種因素相關。一是與有害微生物爭奪營養物質；二是分泌產生多種抗菌代謝物，如有機酸、細菌素、細菌素樣底物(BLS)、去結合膽汁酸、醇和H2O2等，這些化合物的作用通常通過多種不同的機制來實現，包括酸化、抑制DNA回旋酶或RNA聚合酶活性、在細胞質膜上形成孔隙、氧化和改變脂質Ⅱ的活性；三是益生菌產生的代謝物之間的相互作用，具有生長抑制潛力的益生菌代謝產物被認為有重要的研究價值[6]。

1.1 益生菌產生抗菌物質 益生菌通過多種機制對宿主產生作用，包括產生代謝產物，如有機酸和細菌素，具有強大的抗菌活性。益生菌通過在敏感微生物的細胞膜上形成孔隙，從而發揮抗菌作用。益生菌能夠在胃腸道定值，刺激分泌細菌素，保護宿主不受感染。細菌素可以保護機體抵抗多種致病菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌和沙門氏菌等。潘氏細胞通過釋放抗菌肽以應對腸道病原菌的刺激，促進腸上皮細胞的先天免疫應答。益生菌能夠分泌有機酸、過氧化氫、細菌素等抗菌物質，阻止病原菌的粘附和定值[7]。益生菌產生的代謝物起到殺滅、定植和信號肽的作用，因此，它們能夠抑制病原體的侵襲，調節宿主免疫系統，并改變胃腸道微生物群的組成[6,8,9]。益生菌含有多個基因位點，編碼抗菌物質的產生是其在一個異質微生物群落中持續生存的基本生存特征。它們可以起到以下作用：(a)定植輔助物-促進生產菌株進入已被其他微生物占據的現有生態位；(b)殺死肽-抑制競爭對手的增殖；(c) 信號肽-通過群體感應和異質群體中的細菌串擾或通過向宿主免疫系統細胞發送信號來影響其他細菌[10]。細菌素可以作為免疫系統的傳感器，表明新的細菌攻擊正在發生[11]。據報道，芽孢桿菌屬擁有強大的抗菌藥物庫，枯草芽孢桿菌NCIB 3610可產生一種具有抑制兩種魚類病原體活性的抗菌化合物混合物，對新藥物的研發有重要的參考價值[12]。

1.2 益生菌的粘附特性 細胞表面疏水性和自聚集性在細菌粘附腸上皮細胞中具有競爭優勢，并防止益生菌在蠕動過程中從人體腸道排出。益生菌具有粘附和共聚能力，益生菌通過黏附素結合到宿主細胞的受體上，與致病菌競爭與宿主的結合位點，通過占位保護性作用來抑制致病菌的生長和繁殖[13]。鼠李糖乳桿菌的SpaCBA-pili在粘附、宿主信號傳導、生物膜形成和糞腸球菌等病原體的競爭性排斥等方面發揮關鍵作用。SpaC在鼠李糖酵母菌強黏附表型中起關鍵作用[14]。益生菌的表面粘附特性，如疏水性和聚集性是益生菌篩選要素中的重要性能。革蘭氏陽性桿菌胞外基質蛋白作為內皮細胞定殖的橋梁，在胃腸道與宿主細胞的粘附接觸中起著重要作用。細菌與胃腸道的粘附是一個復雜的過程，涉及一些非特異性和特異性的細胞外和細胞表面配體受體。

1.3 益生菌能夠產生免疫球蛋白A 免疫球蛋白A (IgA)是體液免疫反應的一部分，具備基本的適應性免疫反應和必要的粘膜屏障功能[15-16]。IgA可與共生菌、病原菌和毒素結合，優化樹突狀細胞作用和整體免疫反應。研究表明益生菌可以誘導分泌產生IgA，協同維持免疫監視。粘膜表面由高度多樣的共生微生物群定殖。分泌型IgA(SIgA)可促進共生菌的存活，同時對病原菌的入侵起抑制作用。細菌包衣可以通過抗原特異性SIgA識別、多反應性和SIgA相關聚糖介導。研究表明從SIgA中去除N-聚糖會降低SIgA介導的保護作用。粘膜的表面，尤指腸道，被大量高度多樣性的微生物群定植。在不損害粘膜組織完整性的前提下的生理區室的微生物群參與了先天免疫和特異性免疫的互補機制的復雜相互作用。體內細菌被粘膜抗體包裹，在人類中主要是同種型的SIgA，在對抗致病微生物的同時也能夠促進內源性共生粘膜微生物群的成功存活和遏制。然而，尚不清楚這種細菌涂層是否完全依賴于高度特異性抗體活性，多反應性，以及IgA相關聚糖與微生物互補結構的相互作用[17]。

1.4 益生菌代謝產生的代謝產物 益生菌發酵產生的短鏈脂肪酸可與細胞表面G蛋白偶聯受體結合，間接調節免疫功能，這些化合物可以通過抑制組蛋白去乙酰化酶來調節基因轉錄，促進B細胞分化和抗體合成，改善抗原-抗體反應[18-19]。微生物群代謝產生的其他代謝產物是與免疫系統密切相關的必需氨基酸，如色氨酸[20]。色氨酸代謝產物通過減弱TNF-α激活NF-κB和減少促炎趨化因子的表達，除加強腸上皮屏障緊密連接外，腸道菌群還可以通過合成復合B族維生素，在調節免疫系統中發揮重要作用[21]，如枯草芽孢桿菌能產生必需的營養物質(氨基酸、維生素等)促進動物生長[22]。

除此之外，特異性益生菌調節緊密連接蛋白的表達，協同保護腸上皮細胞上皮的完整性。益生菌處理后的上皮細胞中ZO-1和其他緊密連接蛋白的表達水平高于單獨感染病原菌的上皮細胞。益生菌菌株(乳酸菌、雙歧桿菌和鏈球菌)也被證明可以調節黏液蛋白的表達，改善黏液層的特性，并間接支持腸道免疫系統，黏液層形成了保護膜避免了致病微生物的粘附。益生菌還可以調節腸上皮細胞和樹突狀細胞的基因表達。益生菌已被證明通過維持和恢復上皮功能，維持粘膜免疫穩態和抑制致病菌來促進腸道健康[23]。

1.5 益生菌衍生可溶性因子 益生菌衍生因子是益生菌的功能成分。功能性益生菌衍生因子包括益生菌產品(蛋白質分子、碳水化合物和細胞壁成分)和代謝物(由益生菌制成)的鑒定，已經發現了一條解釋益生菌與宿主相互作用的新途徑。這些因子已被證明可以調節宿主的反應，并被認為是治療的靶點。益生菌的功能也可能與宿主遺傳和環境因素有關。宿主遺傳學和環境影響腸道微生物群的組成和功能。作為腸道微生物群的組成部分，益生菌衍生因子與宿主之間的相互作用已經成為研究益生菌介導宿主免疫機制的熱點[24]。

2 益生菌在畜禽養殖業中的應用

當今世界，各種細菌病和病毒病對各國畜禽養殖業帶來了巨大的經濟損失。針對于細菌病，由于抗生素的濫用，使得細菌耐藥性增加，同時肉產品中藥物的殘留，也給人類的健康構成一定的威脅。針對于各種病毒病，疫苗預防仍然是主要的方法。但是傳統疫苗只能針對單一血清型的病毒產生抗體，具有局限性。越來越多的研究表明使用益生菌在預防畜禽養殖業中的細菌病和病毒病發揮了重要作用。

2.1 大腸桿菌 在畜禽養殖業中，大腸桿菌是危害養殖動物的主要疾病之一，每年因為大腸桿菌相關疾病的發生給養殖業直接或間接地造成了重大的經濟損失[25]。大腸桿菌廣泛存在于自然界，能使雞的免疫功能受到抑制，可在體內大量繁殖，引起腹膜炎、輸卵管炎和肺炎等疾病。良好的飼養管理是保證該病低發病率的關鍵。益生菌作為飼料添加劑預防雞大腸桿菌病的發生具有顯著的功效。先前的研究表明，日糧中添加植物乳桿菌可改善腸道健康，降低因大腸桿菌攻擊造成的死亡率[26]。有研究表明唾液乳桿菌通過減少大腸桿菌O78的定植而顯示出對大腸桿菌O78攻擊的保護作用[27]。Yoda的研究表明經口給予格氏乳桿菌TMC0356(TMC0356)可使小鼠大腸桿菌病早期癥狀消失加快，死亡率明顯降低。與對照組相比，經口給予TMC0356的大鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性和白IL-6產生顯著增加(P<0.05)。這些結果提示部分乳酸菌可通過增強宿主的天然免疫功能，保護宿主免受EPEC感染，減輕感染引起的癥狀[28]。Guo的研究表明在大腸桿菌攻擊后檢測心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟中的大腸桿菌含量發現，飼喂枯草芽孢桿菌組的雞的大腸桿菌含量明顯低于對照組。此外，枯草芽孢桿菌可觸發Toll樣受體4(TLR4)，誘導雞產生促炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和IL-8)以產生先天性免疫應答[29]。

2.2 雞新城疫病毒 新城疫是一種病毒性疾病，在大多數鳥類中引起呼吸困難、眶周水腫和共濟失調。由于新城疫病毒(NDV)的低反應性和多劑量需求，現有的疫苗受到限制。Bautista-Garfias的研究表明雛雞服用干酪乳桿菌后接種新城疫病毒，與空白對照組相比，死亡率可由22.22%降低至5.55%，同時對雞的體重也顯著增加[30]。枯草芽孢桿菌BYS2被證明能降低感染組織和器官中的新城疫病毒(NDV)載量，顯著增加感染雞的存活率(P<0.05)。通過ELISA檢測發現BYS2能提高肉雞血清中IgG水平和IgM水平，主要模式識別受體(PRRs)、抗病毒蛋白、促炎細胞因子和抗病毒防御素的表達也明顯顯著高于對照組(P<0.05)。與此同時，實驗組肉雞的法氏囊免疫器官指標明顯高于對照組(P<0.05)[29]。

2.3 禽流感病毒 禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)屬甲型流感病毒，能引起鳥類和哺乳動物呼吸道癥狀的傳染性疾病[31]。全世界家禽中都有禽流感病毒的報道，禽流感病毒對人類健康的影響是巨大的。因血清型眾多，禽流感疫苗很難針對所有的血清型都產生作用。從韓國泡菜中分離得到的腸系膜明串珠菌YML003具有抗H9N2亞型禽流感病毒活性、免疫調節作用、胃液和膽汁耐受性以及對抗生素的耐藥性，是家禽應用的理想益生菌候選菌株[32]。L QY等[33]構建并表達了流感抗原NP和M2與鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC的融合蛋白，對雛雞進行口服免疫，檢測血清抗體、黏膜抗體和特異性細胞免疫發現分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和IgG的表達水平均增加，可誘導雞脾臟產生強T細胞免疫應答。同時重組NC8-pSIP409-pgsA'-NP-M2-FliC介導的有效保護雞流感病毒，并降低病毒在肺部的滴度。該研究證實了植物乳桿菌表達流感病毒NP-M2和黏膜佐劑(FliC)可以為動物產生一種黏膜疫苗候選物，以抵御禽流感病毒的感染。該研究為開發新型高效的植物乳桿菌(L.plantarum)口服疫苗以控制禽流感病毒在家禽業的傳播奠定了基礎。

2.4 傳染性法氏囊病毒 傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)感染會給家禽生產造成巨大的經濟損失，接種疫苗是預防該病的重要途徑之一。然而，由于IBDV對機體的免疫抑制，疫苗接種的效果往往不盡人意。氧化應激是家禽免疫抑制的常見原因[34-35]。因此，近年來，降低氧化應激影響的營養性飼料添加劑越來越受到重視。乳酸菌作為第一個被官方認可的微生物飼料添加劑，由于其生產成本低、利用率高而具有無可比擬的優勢。Jian Wang的研究證實，唾液乳桿菌可增強IBDV疫苗接種后的免疫應答[26]。

2.5 輪狀病毒 輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬呼腸孤病毒科，常引起多種幼齡動物急性腹瀉，對畜牧業發展有較大危害。輪狀病毒分多種型，因而使得輪狀病毒病的防控存在難度[36]。乳酸桿菌是主要的革蘭氏陽性益生菌之一，在人和豬的腸道中也有共棲體。鼠李糖乳桿菌GG株(LGG)對輪狀病毒病的作用已在大量臨床試驗中得到證實，包括縮短輪狀病毒腹瀉的持續時間，減少腹瀉發作次數，減少輪狀病毒的脫落，使腸道通透性正常化，增加輪狀病毒特異性抗體的產生[37-38]。將豬輪狀病毒(PRV)OSU株與嗜酸乳桿菌(LA)或鼠李糖乳桿菌GG(LGG)共同接種IPEC-J2細胞。在輪狀病毒感染前后應用LA或LGG治療。研究結果表明LA和LGG處理的細胞并沒有減少病毒的復制。PRV感染刺激了粘蛋白3分泌的增加，而LGG治療輪狀病毒感染的細胞減少了PRV誘導的粘蛋白分泌反應。LGG單獨處理可增加膜結合型粘蛋白3的產生，但不增加粘蛋白的分泌，提示LGG通過維持和增加MUC3粘蛋白的膜結合形式對上皮細胞起保護作用，其作用是減少輪狀病毒顆粒對上皮細胞的粘附。

除此之外，益生菌還可作為一種環境改良益生菌在凈化養殖舍內空氣、糞便發酵生產有機肥、廢水發酵處理中同樣發揮重要作用，對養殖業的可持續生態循環發展有重要的參考價值[39]。

3 小結與展望

抗生素的廣泛使用使得畜禽的耐藥性增加，耐藥范圍正在擴大，不僅無法治療畜禽疾病，且細菌抗性基因會通過多種途徑傳播到外界環境中，造成環境污染，嚴重危害公共衛生安全[40]。新的抗病毒藥物的開發就顯得尤為迫切。

目前隨著生物技術的發展，越來越多的研究表明益生菌在調節腸道菌群、提高機體免疫力、治療人畜疾病以及促進人類健康和畜牧生產中發揮重要作用。目前，選擇正常菌群的乳酸菌為載體，構建重組乳酸菌已在預防細菌、病毒、寄生蟲等病原感染宿主方面迅速開展起來，將它們用于預防相應疫病模型中均已取得了較好的防治效果[41]。但是研究表明益生菌在實際應用當中還存在著菌種存活率低、難以在腸道定值的問題，這就需要未來研究者在菌種篩選、加工、貯存和臨床評價等方面進一步研究來提高益生菌的益生效能[42]。

研究表明，益生菌功能受環境溫度、益生菌菌種、管理水平和動物種類等因素的影響。益生菌作為腸道微生物群的組成部分，其功能也可能與宿主遺傳和環境因素有關。目前，益生菌與宿主之間的相互作用正在成為研究益生菌介導宿主機體的靶點。使用益生菌作為載體直接向腸道輸送抗感染和腸道上皮修復因子可能是未來益生菌應用的一個顯著進步。目前的證據突出了益生菌和益生菌衍生因子在支持宿主體內平衡方面的潛力，在畜禽養殖和畜禽疾病的預防治療方面具有較強潛力[24]。相信隨著對益生菌作用機理的進一步研究，益生菌將會給畜禽業帶來更多的福利。