低氧環境下PLGA/膠原纖維支架對小鼠骨髓間充質干細胞增殖及成肌腱分化影響

姜楊　侯繼野　張曉東　徐桂清　王玉　沈雷　吳雨軒

[摘要] 目的 探討低氧環境下PLGA/膠原纖維支架對小鼠骨髓間充質干細胞（mBMSCs）增殖及成肌腱分化的影響。方法 利用靜電紡絲技術制作出30組PLGA/膠原纖維支架，正常條件下培養的mBMSCs為正常對照組;以3%O2，5%CO2，92%N2建立細胞低氧模型，在低氧環境下培養mBMSCs為低氧對照組，mBMSCs種植在PLGA/膠原纖維支架為低氧支架實驗組，各組均進行成肌腱分化誘導實驗14 d。CCK-8實驗檢測3 d、5 d、7 d各組mBMSCs增殖的吸光度值，ELISA實驗檢測各組mBMSCs上清液肌腱細胞標志性蛋白Tenomodulin和Scleraxis含量。結果 在3 d、5 d、7 d觀察點內，正常對照組、低氧對照組、低氧支架實驗組mBMSCs吸光度值差異有統計學意義（P<0.05），第3 d、5 d、7 d觀察點內，低氧對照組mBMSCs吸光度值均高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01）;與低氧對照組相比，低氧支架實驗組3 d、5 d、7 d吸光度A值均分別增高，差異有統計學意義（P<0.01）。在細胞低氧環境下，低氧支架實驗組Tenomodulin蛋白（4.526±0.002）μmol/L和Scleraxis蛋白（3.752±0.004）μmol/L含量高于低氧對照組Tenomodulin蛋白（2.831±0.023）μmol/L和Scleraxis蛋白（2.457±0.032）μmol/L，低氧對照組Tenomodulin蛋白（2.831±0.023）μmol/L和Scleraxis蛋白（2.457±0.032）μmol/L含量高于正常對照組Tenomodulin蛋白（1.542±0.071）μmol/L和Scleraxis蛋白（1.136±0.056）μmol/L，3組對比差異有統計學意義（P<0.01）。結論 低氧環境下PLGA/膠原纖維支架可有效促進mBMSCs增殖和成肌腱分化。

[關鍵詞] 細胞低氧;PLGA/膠原纖維支架;間充質干細胞;細胞增殖;成肌腱分化

[中圖分類號] R329 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2020）11（a）-0001-05

Effects of PLGA/collagen Fiber Scaffold on the Proliferation and Tendon Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells under Hypoxia

JIANG Yang1， HOU Ji-ye2， ZHANG Xiao-dong1， XU Gui-qing1， WANG Yu1， SHEN Lei1， WU Yu-xuan3

1.School of Basic Medicine， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China; 2.Department of Intervention， Qiqihar Jianhua Hospital， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China; 3.Department of Endocrinology， Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China

[Abstract] Objective To investigate the effect of PLGA/collagen fiber scaffold on the proliferation and tendon differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells （mBMSCs） under hypoxic environment. Methods Thirty groups of PLGA/collagen fiber scaffolds were fabricated by electrospinning technology. The mBMSCs cultured under normal conditions served as the normal control group; the hypoxia model of cells was established with 3% O2， 5% CO2， and 92% N2， under hypoxia environment cultivated mBMSCs served as the hypoxic control group， and mBMSCs planted on PLGA/collagen fiber scaffolds served as the hypoxic scaffold experimental group. Each group was subjected to tendon differentiation induction experiments for 14 d. CCK-8 experiment was used to detect the absorbance value of mBMSCs proliferation in each group on 3 d， 5 d， 7 d， and the content of Tenomodulin and Scleraxis in the supernatant of mBMSCs in each group was detected by ELISA. Results Within the observation points of 3， 5， and 7 d， the absorbance values of mBMSCs in the normal control group， hypoxia control group， and hypoxia stent experimental group were significantly different （P<0.05）. On the 3rd， 5th， and 7th day， in the observation point， the absorbance values of mBMSCs in the hypoxic control group were all higher than those of the normal control group，the difference was statistically significant（P<0.01）; compared with the hypoxic control group， the absorbance A values of the hypoxic stent experimental group were increased at 3， 5， and 7 d respectively，the difference was statistically significant（P<0.01）. In the hypoxic environment， the contents of Tenomodulin protein （4.526±0.002） μmol/L and Scleraxis protein （3.752±0.004） μmol/L in the hypoxic stent experimental group were higher than those in the hypoxia control group Tenomodulin protein （2.831±0.023）μmol/L And Scleraxis protein （2.457±0.032）μmol/L， the hypoxic control group Tenomodulin protein （2.831±0.023）μmol/L and Scleraxis protein （2.457±0.032）μmol/L content were higher than the normal control group Tenomodulin protein （1.542±0.071）μmol/L and Scleraxis protein （1.136±0.056）μmol/L， the difference between the three groups was statistically significant （P<0.01）. Conclusion The PLGA/collagen fiber scaffold can effectively promote the proliferation and tendon differentiation of mBMSCs under hypoxia.

綜上所述，在低氧環境下PLGA/膠原纖維支架材料與間充質干細胞有良好的相容性，支架材料促進間充質干細胞的增殖和分化，在體外實驗模擬機體微環境為肌腱損傷修復提供給一個有力的實驗依據。但在低氧環境下PLGA/膠原纖維支架材料促進間充質干細胞分化肌腱細胞生物化機制不明確，還需要深入研究探索，今后將研究低氧環境下詳細細胞信號通路，為干細胞組織工程加速修復損傷肌腱，為臨床上再生和修復肌腱奠定實驗研究基礎。

[參考文獻]

[1] ?楊健，葛建忠.修復運動性肌腱損傷組織工程化肌腱及種子細胞和支架材料[J].中國組織工程研究，2015，19（51）：8333-8337.

[2] ?胡靜，李章華.干細胞治療閉合性不完全肌腱損傷的研究進展[J].中國醫藥導報，2019，16（25）：32-36，48.

[3] ?李丹，郭杏，譚美云.低氧環境對脂肪源性間充質干細胞生物學特性的影響[J].西南醫科大學學報，2017，40（2）：202-205.

[4] ?郭勁書. 腱-骨愈合用硅磷酸鈣復合材料的設計、制備及性能研究[D].中國科學院大學（中國科學院上海硅酸鹽研究所），2019.

[5] ?羅蕓，馬俊，錢前，等.不同低氧濃度對人臍帶間充質干細胞向神經細胞分化的影響[J].解放軍醫藥雜志，2019，31（8）：6-11.

[6] ?Ju X， Xue D， Wang T， et al. Catalpol Promotes the Survival and VEGF Secretion of Bone Marrow-Derived Stem Cells and Their Role in Myocardial Repair After Myocardial Infarction in Rats [J].Cardiovasc Toxicol，2018，18（5）： 471-481.

[7] ?Song F，Jiang D，Wang T， et al. Mechanical Loading Improves Tendon-Bone Healing in a Rabbit Anterior Cruciate Ligament Reconstruction Model by Promoting Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cells and Tendon Cells [J].Cellular Physiology and Biochemistry， 2017， 41（3）： ?875-889.

[8] ?Teng C， Zhou C， Xu D， et al. Combination of platelet-rich plasma and bone marrow mesenchymal stem cells enhances tendon-bone healing in a rabbit model of anterior cruciate ligament reconstruction[J].J Orthop Surg Res，2016，11（1）： 96.

[9] ?Yang X， Li Y， Liu X， et al. Incorporation of silica nanoparticles to PLGA electrospun fibers for osteogenic differentiation of humanosteoblast-like cells[J].Regen Biomater， 2018， 5（4）： 229-238.

[10] ?姜楊，李永濤，徐桂清，等.低氧環境下SDF-1對間充質干細胞遷移影響的初探[J].系統醫學，2018，3（15）：13-15.

[11] ?楊曉鵬.殼聚糖-膠原支架引導牙周骨組織再生的實驗研究[J].中國民康醫學，2018， 30 （4）：68-69，72.

[12] ?田曉紅，張彬，房艷，等.大鼠脂肪源性干細胞與三維打印明膠支架的相容性[J].解剖學報，2017，48（2）：209-215.

[13] ?賈巖波，梁子紅，任逸眾，等.同種異體肌腱移植重建治療膝關節前交叉韌帶斷裂：中期隨訪評價[J].中國組織工程研究，2015，19（42）：6764-6769.

[14] ?張新濤，江華基，梁祖儒，等.骨碎補總黃酮通過激活mTOR信號通路促進大鼠腱骨愈合的實驗研究[J].中國骨傷，2018，31（3）：248-253.

[15] ?馮鵬飛，王繼宏，冀云濤，等.肌腱組織工程材料在肌腱損傷的應用特點及前景[J].中國組織工程研究，2017，21（18）：2940-2945.

[16] ?袁曉偉. 載CS-nHA/zein-SIM微球復合明膠支架的制備及其促進腱骨愈合的實驗研究[D].長春：吉林大學，2019.

[17] ?汪晶晶. 牛脂肪間充質干細胞生物學特性及治療小鼠肌腱損傷模型的研究[D].哈爾濱：哈爾濱體育學院，2018.

[18] ?Kwak S， Haider A， Gupta KC， et al. Micro/Nano Multilayered Scaffolds of PLGA and Collagen by Alternately Electrospinning for Bone Tissue Engineering[J].Nanoscale Res Lett， 2016， 11（1）： 323.

[19] ?陳嬌，舒莉萍，李軒澤，等.聚乳酸-羥基乙酸共聚物負載人骨髓間充質干細胞構建組織工程骨[J].中國組織工程研究，2019，23（26）：4109-4114.

[20] ?陳鳳浩. 間充質干細胞治療單板U型場地運動員肌腱損傷動物模型的建立研究[D].哈爾濱：哈爾濱體育學院，2017.

（收稿日期：2020-08-01）

[基金項目] 齊齊哈爾醫學院院內科研基金項目（QY2016M-03）。

[作者簡介] 姜楊（1981-），女，碩士，講師，研究方向為組織工程肌組織與肌腱。

[通信作者] 沈雷（1975-），男，博士，教授，研究方向為組織工程肌組織與肌腱，E-mail：shenleiby@126.com。