兩種花椒精油成分GC-MS分析及活性研究*

伍 燕，周中秋，汪 偉，易君明

(興義民族師范學院生物與化學學院，貴州 興義 562400)

花椒為蕓香科花椒屬植物[1]，果實成熟后在果皮部位富含的油腺可揮發出花椒特有的香味和麻味，花椒是調味料中不可或缺的香料，在我國種植面積較廣，在西南地區產量和用量都較大，常用的有紅花椒和青花椒[2-4]。紅花椒(Zanthosylumbungeanum)果實成熟后表皮呈紅色；青花椒(Zanthoxylumschinifolium)果實成熟后表皮呈綠色，二者在麻味和香味上有些區別。紅花椒較香但烹調時間不宜過長，火候掌握不好會返苦；青花椒香味不如紅花椒但麻味稍重且出油率高，因而煉制花椒油多選青花椒，二者結合使用恰當可使菜肴又香又麻[5-6]。花椒性溫味麻，有芳香健胃、溫中散寒、除濕止痛、殺蟲解毒、止癢去腥的功效，是藥食兩用的香料植物[7]。

本研究用水蒸氣蒸餾法提取本地產新鮮紅花椒和青花椒精油，對其成分進行GC-MS分析并研究兩種花椒的可揮發性成分；采用二倍稀釋法比較兩種花椒精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的抑菌活性；采用DPPH和ABTs自由基檢測了兩種花椒精油對體外自由基的清除效率，本研究為黔西南產紅花椒和青花椒的進一步開發利用提供了參考。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

試驗材料：紅花椒和青花椒新鮮果實，7月份購于興義豐源市場。

實驗菌株：大腸桿菌(Escherichiacoil，CICC-10899)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CICC-10786)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，CICC-10002)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，CICC-1002)。

藥品和試劑：ABTs、DPPH，麥克林試劑公司；氯化鋇、濃硫酸、葡萄糖、甲醇、二甲基亞砜等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器和設備

SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50FB高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；DHP-500電熱恒溫培養箱，常州市凱航儀器有限公司；DHG-9246A精宏電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；TQ8040氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 花椒精油提取

按料液比1：4將500 g新鮮紅花椒或青花椒果實放入圓底燒瓶中并加蒸餾水，加熱產生蒸汽后計時1 h提取揮發油，收集精油用干燥NaCl分層去水，4 ℃保存備用[8]。

1.3.2 花椒精油可揮發成分分析

色譜柱：DB-5 MS石英毛細管色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，分流比150：1進樣量1 μL，進樣口溫度250 ℃，程序升溫起始溫度60 ℃，保持1 min，以1.5 ℃/min的速率升至100 ℃，再以5 ℃/min升溫到250 ℃，保持5 min。

質譜條件：電子轟擊(EI)能量70 eV，離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質量掃描范圍為30～550 m/z[9]。

1.3.3 抑菌活性的測定

將精油用DMSO溶解配制成濃度為10000 μg/mL母液；將液體培養的各菌株與麥氏比濁液比對后調整菌液濃度到1×105cfu。

采用二倍稀釋法測定花椒精油的最低抑菌濃度(MIC)，將96孔板的A1～A11孔列為實驗組，A12孔為對照孔，重復三次。細菌用牛肉膏蛋白胨培養基(LA)，真菌用馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)，第1孔和第2孔各加100 μL的上述花椒精油母液，第2～12孔各加100 μL培養基，依次對2～11孔做對倍稀釋；稀釋完后分別在1～12孔中加入100 μL濃度為1×105cfu菌液。加完菌液的96孔板置于30 ℃恒溫培養箱中靜置24 h。實驗結束后比較實驗組與空白對照組混濁度差異，無細菌生長、培養基澄清且無沉淀的孔板內所含精油濃度即為最小抑菌濃度(MIC值)[10]。

1.3.4 花椒精油抗氧化活性的測定

(1)花椒精油工作液配制。稱取適量紅花椒和青花椒精油，用無水乙醇定容成100 mg/mL母液，依次稀釋成80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL不同濃度工作液。

(2)ABTs·清除試驗[11]。取96孔板，按照1:3的比例依次加入不同濃度花椒精油50 μL和ABTs工作液150 μL，混勻后避光靜置6 min，在酶標儀上用734 nm波長測定樣品吸光度值(Ai)；取不同濃度精油50 μL，加150 μL ddH2O，相同波長測定樣品本底吸光度值(Aj)；50 μL的ddH2O加入150 μL的ABTs溶液，相同波長測定陰性對照吸光度值(A0)，每個濃度重復3次。

ABTs自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)DPPH·清除試驗[12]。取96孔板，各濃度花椒精油和0.1 mmol/L DPPH工作液各加100 μL后混勻、避光靜置30 min，調整酶標儀吸光度值在517 nm波長處測定，記錄樣品吸光度值(Ai)；不同濃度樣液100 μL和無水乙醇100 μL混合后同法測定吸光度，記為樣品本底吸光度值(Aj)；無水乙醇 100 μL和DPPH工作液100 μL混合后測定吸光度，記為陰性對照值(A0)。

DPPH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.3.5 數據處理

用ORINIG 9.01、EXCEL 2010處理數據。

2 結果與討論

2.1 紅花椒和青花椒精油的主要成分

圖1和圖2分別為紅花椒和青花椒精油可揮發性成分總離子流程圖，各組分質譜碎片在質譜檢索標準庫NIST 14中進行匹配解析，匹配度達85%以上的紅花椒有63個成分，占揮發性組分的94.35%，青花椒有43個成分，占揮發性組分的99.66%。按峰面積歸一化法計算各成分的相對質量分數，結果如表1所示。

圖1 紅花椒精油揮發油的總離子流圖

圖2 青花椒精油揮發油的總離子流圖

表1 紅花椒和青花椒精油化學成分

續表1

續表1

2.2 花椒精油對各供試菌株的抑制活性

花椒精油對不同病原菌的最小抑菌濃度見表2、表3，青花椒精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果和紅花椒精油無差別，對枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的抑制效果比紅花椒精油表現良好其最小抑菌濃度(MIC)分別為2500 μg/mL和1250 μg/mL。

表2 青花椒精油抑菌實驗結果

表3 紅花椒精油抑菌實驗結果

2.3 花椒精油的抗氧化活性

如圖3所示，對ABTs和DPPH自由基的清除效果，紅花椒精油比青花椒表現好，經各自回歸方程計算，紅花椒對ABTs和DPPH自由基的清除率EC50值分別為0.50和14.29 mg/mL，青花椒對ABTs和DPPH自由基的清除率EC50值分別為68.43和88.98 mg/mL，清除效果相差較大。

圖3 香樟精油對ABTs和DPPH的清除率

3 結 論

蒸餾法提取兩種新鮮花椒精油的紅花椒出油率為0.74%，青花椒為2.22%，青花椒的出油率是紅花椒的3倍；經GC-MS鑒定，紅花椒的成分是63種，青花椒是43種。紅花椒的主要成分是2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔(25.88%)、1,5-二甲基-1,6-環辛二烯(24.03%)、7-(甲基乙亞基)-雙環庚烷(13.12%)、4-萜烯醇(7.16%)和芳樟醇(3.16%)；青花椒的主要成分是二氫卡維醇(39.26%)、金剛烷(23.23%)、2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔(18.69%)、α-小茴香烯(8.43%)和羅勒烯(2.37%)，其中2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔是二者共有成分，其它主要成分在含量和種類上區別很大，這是二者呈現出不同香味的原因。青花椒對枯草芽孢桿菌和酵母菌的抑菌效果比紅花椒的好，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果二者區別不大，這是中醫用花椒外用治療真菌類感染婦科疾病的可靠證據；紅花椒的抗氧化活性比青花椒強，這為紅花椒的抗氧化活性開發利用提供了理論支持。