土壤中產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及產(chǎn)酶研究*

方 舒，李 肖，高玉榮

(巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 巢湖 238000)

蛋白酶是指能夠水解蛋白質(zhì)中氨基酸基團(tuán)之間肽鍵的一種酶，全世界銷售的各種用途的工業(yè)酶中，水解酶約占75%，其中蛋白水解酶約占60%[1-3]。蛋白酶按其產(chǎn)生生物來(lái)源可分為微生物、植物、動(dòng)物，其中微生物產(chǎn)蛋白酶大多為胞外酶，與其它來(lái)源蛋白酶相比，具有來(lái)源廣、種類多樣。另外微生物繁殖、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，及容易控制生長(zhǎng)條件的特點(diǎn)，使得利用微生物產(chǎn)蛋白酶可以降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，因此微生物產(chǎn)蛋白酶成為近年來(lái)酶制劑的主要來(lái)源[4]。由于市場(chǎng)對(duì)蛋白酶需求的增大，產(chǎn)酶菌株的篩選、工程菌株的構(gòu)建表達(dá)、酶基因的克隆以及酶蛋白的純化等相關(guān)技術(shù)日趨成熟并得到廣泛應(yīng)用[5]。

安徽巢湖半湯溫泉是中國(guó)溫泉之鄉(xiāng)，溫泉資源豐富，獨(dú)特的溫泉環(huán)境孕育了獨(dú)特的生物類群，溫泉土壤中豐富的微生物資源有待開(kāi)發(fā)研究。本研究旨在采用牛奶平板透明圈法從巢湖半湯溫泉附近土壤中篩選分離出一株產(chǎn)蛋白酶能力高的菌株，并對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及產(chǎn)蛋白酶活力進(jìn)行研究，為后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

取安徽巢湖半湯溫泉附近土層下方5～10 cm處土樣，裝入無(wú)菌袋中，置于實(shí)驗(yàn)室冰箱中，4 ℃保存，待用。

1.2 主要儀器與試劑

THZ-82A氣浴恒溫振蕩器，常州普天；LDZM-50KBS高壓蒸汽滅菌器，上海申安；HC-3016R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳；SHP-160DA高低溫培養(yǎng)箱，上海申安；UV-5200PC紫外分光光度計(jì)，上海元析；SMART生物顯微鏡，重慶奧特；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電。

福林酚，上海滬試；革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋；非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管，杭州微生物；干酪素、蛋白胨、LB肉湯、酵母浸膏，北京奧博星；脫脂奶粉，內(nèi)蒙古伊利；其它未列化學(xué)試劑均為分析純級(jí)，所有用水均為超純水。

1.3 培養(yǎng)基

試驗(yàn)中所需使用到的培養(yǎng)基配制如下所示[6]。

1.3.1 牛奶平板

在普通肉湯固體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為15 g/L的牛奶。脫脂奶粉用超純水溶解，在0.06 MPa條件下滅菌30 min，倒平板前再與肉湯蛋白胨固體培養(yǎng)基(121 ℃，滅菌15 min)混合。

1.3.2 種子培養(yǎng)基

按照蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，超純水1 L的比例準(zhǔn)確稱取試劑，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.1，121 ℃，滅菌15 min。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

配制方法同上1.3.2，溫度組和接種量組調(diào)節(jié)pH 7.0～7.1，pH組根據(jù)設(shè)定的pH調(diào)節(jié)初始pH值。

1.4 方 法

1.4.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩[7]

稱取1 g土壤樣品置于含玻璃珠的無(wú)菌試管中，加入10 mL無(wú)菌水，置于氣浴恒溫振蕩器內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速170 rpm，充分振蕩10 min。吸取1 mL土壤懸浮液置于新無(wú)菌試管中，加入9 mL無(wú)菌水混勻制成10倍稀釋液，吸取1 mL 10倍稀釋液置于新無(wú)菌試管中，并加入9 mL無(wú)菌水，混勻制成100倍稀釋液，依此類推制成1000倍、10000倍稀釋液。每種稀釋液均勻涂布3塊牛奶平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃、培養(yǎng)24 h。牛奶平板上長(zhǎng)出的菌落周圍若有透明水解圈，即為產(chǎn)蛋白酶菌株。

1.4.2 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩[8-9]

挑取初篩牛奶平板上產(chǎn)生透明圈的菌落，移至盛有10 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中充分混勻，吸取1 mL稀釋菌液，移至盛有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中制成稀釋菌液，用接種環(huán)蘸取稀釋菌液，在3塊牛奶平板上進(jìn)行劃線操作，37 ℃、培養(yǎng)24 h。待平板上長(zhǎng)出菌落后，連續(xù)劃線操作2～3輪進(jìn)行純化，直至篩選出透明圈最大的單菌落，并計(jì)算其透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值，選取D/d比值較大的菌株接種到斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存，備用。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察

用接種環(huán)挑取少量斜面培養(yǎng)基上的菌苔，接種到牛奶平板上，37 ℃、培養(yǎng)24 h，取菌株進(jìn)行革蘭氏染色操作，并測(cè)定菌體大小[6,10]。

1.6 生理生化特性鑒定

用接種針蘸取牛奶平板上少量菌株接種到生理生化特性鑒定管中，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃、培養(yǎng)24 h。通過(guò)觀察鑒定管顏色變化，鑒定出該菌株的生理生化特性[11]。

1.7 種子液的制備

用接種環(huán)挑取適量保存在斜面培養(yǎng)基上的菌苔，接種到種子培養(yǎng)基中，無(wú)菌透氣膜封住瓶口，置于氣浴恒溫振蕩器中，37 ℃、170 rpm、培養(yǎng)24 h，制成種子液。

1.8 發(fā)酵液的制備

按照液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積2%的比例吸取保存在種子液中的培養(yǎng)物，接種到10瓶(溫度標(biāo)識(shí)為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃；初始pH標(biāo)識(shí)為5、6、7、8、9)發(fā)酵培養(yǎng)基中，無(wú)菌透氣膜封住瓶口。同上，按照液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積1%、2%、3%、4%、5%的比例吸取保存在種子液中的培養(yǎng)物，接種到5瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，無(wú)菌透氣膜封住瓶口。除溫度標(biāo)識(shí)組發(fā)酵液培養(yǎng)溫度設(shè)置不同外，其它培養(yǎng)條件均設(shè)置為37 ℃、170 rpm、培養(yǎng)24 h。

1.9 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

吸取5種不同(溫度、初始pH、接種量)下培養(yǎng)的發(fā)酵液至離心管中，10000 rpm離心10 min，吸取上清液至新離心管中，-20 ℃保藏備用，即為粗酶液。采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活力，蛋白酶活力單位定義：特定條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量稱為一個(gè)酶活力單位，以U/mL表示[12-13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)及生理生化特性

2.1.1 菌落形態(tài)

牛奶平板上的菌落邊緣不整齊，形狀類似圓形，表面粗糙中央突起，顏色呈污白色，且不透明，如圖1所示。

圖1 產(chǎn)蛋白酶菌株

最終篩選出的產(chǎn)蛋白酶菌株，命名為菌株LX03，D/d=1.757，如圖2所示。

圖2 產(chǎn)蛋白酶菌株LX03

2.1.2 菌體形態(tài)

菌株LX03經(jīng)革蘭氏染色后，菌體呈紫色，桿狀，大小為0.9 μm×2.5 μm，如圖3所示。

圖3 菌株LX03革蘭氏染色

2.1.3 生理生化特性

菌株LX03的生理生化特性鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株LX03生理生化特性

菌株LX03在精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、尿素、七葉苷、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖鑒定管中均有顏色變化，結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明菌株LX03細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)酶系，可以分解利用這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 菌株LX03產(chǎn)酶條件研究

2.2.1 溫度對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶的影響

由圖4分析可知，菌株LX03隨著培養(yǎng)溫度的升高(20～40 ℃)酶活力逐步升高，40 ℃時(shí)達(dá)到峰值，產(chǎn)酶最高；隨著溫度升高酶活力逐漸降低，酶活力高的溫度范圍是35～45 ℃。微生物不僅生長(zhǎng)受溫度影響，其產(chǎn)酶也受溫度影響，培養(yǎng)溫度會(huì)影響微生物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酶促反應(yīng)穩(wěn)定性，并造成對(duì)產(chǎn)酶的影響。

圖4 溫度對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶的影響

2.2.2 初始pH對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶的影響

由圖5分析可知，菌株LX03酶活力在初始pH 5～8范圍內(nèi)逐漸升高；pH大于8時(shí)酶活力逐漸下降，最適pH為8時(shí)產(chǎn)酶最高。微生物細(xì)胞新陳代謝和酶促反應(yīng)都與細(xì)胞環(huán)境pH值有關(guān)，培養(yǎng)基初始pH會(huì)影響微生物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，影響酶的產(chǎn)生以及酶的跨膜運(yùn)輸，并造成對(duì)產(chǎn)酶的影響。

圖5 pH對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶的影響

2.2.3 接種量對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶的影響

由圖6分析可知，接種量對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶存在較大影響，接種量為4%時(shí)酶活力達(dá)到峰值，產(chǎn)酶最高；以接種量4%為界，1%～4%酶活力逐步增加，大于4%時(shí)隨著接種量的增加酶活力反而下降。接種量的大小對(duì)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶也有著較大影響，接種量越高，產(chǎn)酶量不一定越高，較高的接種量可能致使發(fā)酵初期產(chǎn)酶微生物的細(xì)胞濃度較高，吸收大量營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致產(chǎn)物合成時(shí)缺乏營(yíng)養(yǎng)，不利于產(chǎn)物合成，因此接種量的選擇十分重要[14-15]。

圖6 接種量對(duì)菌株LX03產(chǎn)酶的影響

3 結(jié) 論

本研究從安徽巢湖半湯溫泉附近土壤中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶菌株，命名為菌株LX03。菌株LX03為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，可以利用精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、枸櫞酸鹽、硝酸鹽、尿素、七葉苷、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液初始pH、接種量均影響菌株LX03的產(chǎn)酶狀況。研究結(jié)果表明培養(yǎng)溫度為40 ℃，發(fā)酵液初始pH為8，接種量為4%時(shí)，菌株LX03產(chǎn)蛋白酶量最高。