藥用枇杷葉黃酮的制備工藝及分析方法研究

張培培，程愛民，王 超，周 浩

(揚州市職業大學，江蘇 揚州 225007)

2020年初的新冠肺炎疫情突如其來，給中國乃至世界帶來了影響。隨著人們對于新冠肺炎的了解加深，治療方案也呈現出多元化趨勢。目前已有案例表明，中藥對于輕癥患者有明顯的改善功效，可有效阻止患者的病情向重癥方向發展。中藥的應用存在兩個方面的問題，其一，其有效成分是否具有明顯的抗病毒和護肺功效。抗病毒功效的體現可以從提高免疫力的角度出發，而“護肺”功效則是阻止病情惡化的關鍵一環；其二，有效成分在患者口服后能否直接到達病灶部位，血藥濃度是否達標，能否有針對性地解決局部組織或器官的問題。枇杷葉為薔薇科植物枇杷的葉子。又名巴葉、蘆桔葉。枇杷葉中含有揮發油、三萜酸類、黃酮類、皂苷類、有機酸類等多種化學成分，有效成分主要為黃酮類化合物和多糖類物質，因此具有抗炎止咳、保護肺臟，降血糖、抗病毒、抗衰老和抗腫瘤等藥理活性[1-2]。選用枇杷葉提取物及卵磷脂脂質體的形式來制備緩釋片劑，可有效解決上述的兩個方面的問題。本文是基于上述課題的部分內容開展的相關實驗結果。

目前，枇杷葉中黃酮類化合物的提取方法主要包括：溶劑浸取法、微波提取法、pH梯度萃取法、柱色譜法、HPLC色譜法等等。其中溶劑法的關鍵在于溶劑的選擇，溶劑選取的主要依據有兩個，其一為黃酮類成分的存在狀態(游離、苷)及溶解性；其二為溶劑的溶解性能。考慮到乙醇的溶解范圍較廣且毒性小，枇杷葉中的多糖苷類物質易溶于水，因此多選用乙醇-水作為溶劑。黃酮類化合物的分析方法中常見的顯色反應包括：鹽酸-鎂粉反應、 四氫硼鈉還原反應、鈉汞齊反應等；定量的分析多是通過紫外分光光度法或者高效液相色譜法來實現。

陳榮祥等[3]建立了加速溶劑萃取-超高效液相色譜法測定枇杷葉中齊墩果酸、熊果酸2種主要成分含量的方法。提取方法包括加速溶劑萃取法與超聲提取法。其中加速溶劑萃取法具有簡單快速、準確穩定、重復性好的特點，可用于枇杷葉中齊墩果酸、熊果酸的含量測定。

吳中含等[4]為了研究枇杷葉紫珠Callicarpa kochiana的化學成分及其細胞毒活性和抗炎活性，選用丙酮提取和硅膠柱層析相結合的分離方法進行分離純化，再根據理化性質及波譜數據鑒定所得化合物的結構。結果表明，首次從該植物中分離得到5 個化合物：3,7,3',4'-tetramethyl-quercetin (1)、pachypodol (2)、14α-hydroxyisopimaric acid(3)、14α-hydroxy-7,15-isopimaradien-18-oic acid(4)、(16R)-16,17-dihydroxyphyllolladan-3-one (5)，其中化合物4具有細胞毒活性和抗炎活性。

傅賢明等[5]為開發利用枇杷葉植物資源，采用超聲波法從莆田枇杷葉中提取總黃酮，通過單因素實驗確定了影響總黃酮提取的主要因素及較優水平，然后利用正交實驗法確定了最佳提取工藝，并初步探討了枇杷葉黃酮提取物對酪氨酸酶活性的影響。

廖圓圓等[6]用乙醇浸提法提取枇杷葉總黃酮，提取量的測定選用稱重法。評價總黃酮的抗氧化能力采用羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除體系，以還原力值為指標研究總黃酮提取物的抗氧化效應(維生素C為陽性對照)。結果表明，在一定的濃度范圍內，枇杷葉總黃酮的抗氧化能力隨質量濃度的增加而增強。研究結果還表明，枇杷葉總黃酮具有良好的體外抗氧化活性，能夠很好地清除自由基，而且清除自由基能力與濃度存在量效關系。

鑒于枇杷葉具有多種揮發油成分，多種黃酮類化合物或其他生物活性物質，有良好的抗炎，抗氧化，防衰老，抗病毒，消炎等功效[7-8]，本研究以枇杷葉為原料，對黃酮類化合物提取工藝進行研究，配合緩釋技術，著重對其分析方法進行研究，可有效解決中藥應用中的問題。該研究的主要優勢體現在：(1)具有抗炎保肝、治療腫瘤的功效，復配一些生物活性物質可達到藥效相互增益的效果。 (2)在枇杷葉有效成分的提取工藝上，采用溶劑提取法，與傳統的水提法不同，與現有的溶劑提取法工藝也不相同，新工藝對脂溶性的具有抗炎保肝功效的黃酮化合物的提取效果好。 (3)研究的后期可對復配的處方進行研究，開發出新的復配處方。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀 器

AB204S電子分析天平，深圳市三利化學品有限公司；KQ-500型超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀，上海天凡藥機廠；D2F-6020型真空干燥箱，上海三發科學儀器有限公司；紫外分光光度儀，青島聚創環保集團有限公司；Waters高效液相色譜儀，北京京科瑞達科技有限公司。

1.1.2 材料與試劑

枇杷葉提取物，自制；蘆丁對照品(批號：100080-200707)，中國藥品生物制品檢定所；藥用乙醇(批號：20170805)，安徽安特生物化學有限公司。

1.2 實驗條件

高效液相色譜條件：Agilent 1220高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；

色譜柱：shin-packVP-ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流動相：甲醇-水(60：40，V/V)；

流速：0.80 mL·min-1；

柱溫：25 ℃；

檢測波長：300 nm。

1.3 工藝路線

枇杷葉提取物的制備工藝：

選料-清洗-烘干-粉碎-浸提(超聲波提取)-抽濾-減壓蒸餾-收集餾分(產品1)-脫色干燥-制粉得到枇杷葉提取物A

在實際的研究工作中，我們針對三個重要的影響因素開展了單因素實驗，包括：浸提液的組成、微波作用溫度以及固液比等因素。單因素的實驗結果如下：

圖1選用的固液比為1：20，微波作用的時間為30 min，溫度為70 ℃。由實驗結果可知，最佳的浸提液的組成為70%(V/V)的乙醇水溶液。

圖2選用的固液比為1：20，微波作用的時間為40 min，浸提液的組成為70%(V/V)的乙醇水溶液。由圖2可知，最佳的微波提取溫度為70 ℃。

圖3微波作用的時間為40 min，溫度為70 ℃，浸提液的組成為70%(V/V)的乙醇水溶液。由于實驗過程中溶劑用量不同，因此需要將產品定容后再比較其純度大小。由圖3可知，最佳的固液比為1：30。

圖1 浸提液的組成單因素實驗

圖2 微波作用溫度單因素實驗

圖3 固液比單因素實驗

2 枇杷葉中黃酮類化合物分析方法的建立

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品100 mg至250 mL量瓶中，加少量70%乙醇溶解后，加純化水至刻度，取1 mL定容至100 mL容量瓶中，作為對照品溶液備用(0.004 mg/mL)。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取按1.3工藝制備的枇杷葉提取物A 30.0 mg，至250 mL量瓶中，用純化水溶解并定容后，取1 mL定容至100 mL容量瓶中，作為供試品溶液備用。

2.3 準確度與精密度試驗

取蘆丁對照品溶液，0.032 mg/mL、0.04 mg/mL、0.048 mg/mL(分別相當于含量測定的80%、100%、120%)各三份，濾膜過濾后，取續濾液作為供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據峰面積，利用外標法，計算各樣品的含量，根據加入量計算回收率和重復性。另由不同人員不同時間用不同儀器同法測定，計算中間精密度。回收率為100.3%，RSD均小于0.8%,結果見表1。

表1 回收率實驗結果

2.4 耐用性試驗

蘆丁的主峰與其他主要降解產物峰基線分離；另取蘆丁溶液0.01 mg/mL，在不同色譜條件下測定，蘆丁含量測定結果一致。取同一供試液，在不同時間(1、2、4、8) h測定，溶液穩定,結果見表2。

表2 耐用性實驗結果

2.5 產品的純度與含量

利用高效液相色譜法進行定量分析，選用外標法進行含量測定，含量(CX)的計算公式為：

圖4 產品1的高效液相色譜圖

圖5 標準品的高效液相色譜圖

分析檢測結果表明，產品1的峰面積為2148142，標準品的峰面積為3417344，經過計算可得蘆丁的純度為62.86%，含量為0.025 mg/mL。以上結果表明，與同類研究相比，制備工藝簡單易行，且產品純度高，工藝步驟少，適合工業化生產。產品的后期精制過程可選用聚酰胺柱色譜法、硅膠柱層析方法或者pH梯度萃取法以及結晶與重結晶的方法等等。

3 結 論

微波醇提的工藝可有效獲得黃酮類化合物產品，產品純度高達62.86%。利用HPLC-UV分析的固定相選用shin-packVP-ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相選用甲醇-水(60：40， V/V)。分析方法的回收率在100.3%，吸光度的RSD 均小于0.8%，其分析方法的準確度和精密度都較好，完全達到對樣品的測試需要。