長鏈非編碼RNA ZFAS1在食管癌中的表達及作用機制研究

張 千，朱亞寧，周武碧

食管癌是世界上最致命的上消化道癌癥之一[1]，其中食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占90%以上[2]。盡管食管癌的診斷和治療取得了巨大的進步，但患者預后仍然很差，5年生存率僅為20%[3]。因此，有必要對食管癌的致病機理進行深入探究，為其提供新的治療靶點。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNAs)是一種具有超過200個堿基對的非編碼類RNA，在人體的各種生理活動中發揮重要作用。越來越多的研究證實，lncRNAs參與了多種癌癥的發生、發展過程[4]。目前，已發現多種lncRNAs與食管癌的進展有關，如lncRNA UCA1[5]、PEG10[6]等。鋅指結構反義轉錄本1(zinc finger antisense 1,ZFAS1)是新近發現位于染色體20q13的lncRNA，最初發現ZFAS1異常表達于乳腺癌組織和細胞中，隨后有研究發現ZFAS1在肝細胞癌中高表達，且與癌癥的轉移和不良預后有關，另外ZFAS1還被發現可在結腸癌中作為致癌基因發揮促進細胞增殖、抑制凋亡的作用[7]。然而，目前罕有關于ZFAS1在食管癌作用的文獻報道。本研究通過StarBase數據庫預測發現微小RNA(microRNA,miRNA)miR-302b-3p可能是ZFAS1的靶基因。有研究發現miR-302b-3p具有抑制癌細胞增殖的作用[8]。因此，本研究假設lncRNA ZFAS1可通過靶向miR-302b-3p在食管癌中發揮作用。首先檢測食管癌組織和細胞的ZFAS1表達水平，并進一步研究抑制ZFAS1表達對食管癌細胞功能如細胞增殖、遷移和凋亡的影響及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年7月—2017年6月在南京醫科大學附屬淮安第一醫院行食管癌手術切除術的38例患者，收集ESSC和相應癌旁組織(距離原發灶>5 cm)。本研究納入的患者在術前未接受過局部或全身治療。所有組織樣本經液氮冷凍，儲存于-80 ℃超低溫冰箱以供使用。本研究所有患者知情同意，并獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人永生化的正常食管上皮細胞Het-1A及Eca-109細胞系均購自美國ATCC公司，分別使用含有10%胎牛血清(美國Gibco公司)和100 U/mL青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基(dulbecco′s modification of Eagle′s medium,DMEM，瑞士Lonza公司)及RPMI-1640(美國Invitrogen公司)的培養基培養于含5% CO2的37 ℃環境中。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測組織和細胞ZFAS1表達 使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取組織和細胞總RNA成分，分光光度計測得RNA濃度和OD260/280比值。根據說明書逆轉錄(日本Takara公司)獲得cDNA，隨后使用SYBR Green試劑盒(日本Takara公司)在ABI 7300 System PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上進行qRT-PCR檢測。使用GAPDH作為內參基因，GAPDH和ZFAS1引物由中國生工公司代為設計與合成，序列如下：ZFAS1(前引物：5′-AAGCCACGTGCAGACATCTA-3′；后引物：5′-CTACTTCCAACACCCGCATT-3′)，GAPDH(前引物：5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′；后引物：5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′)。采用2?傆bΔΔCt法計算ZFAS1的相對表達量。

1.2.3 細胞轉染和分組 將Eca-109細胞分為3組：空白組、NC干擾組及ZFAS1干擾組。將處于指數生長期的細胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板中，待24 h后根據說明書，使用LipofectamineTM3 000轉染試劑(美國Invitrogen公司)進行ZFAS1干擾RNA(ZFAS1-siRNA)、陰性對照(NC-siRNA)(廣州RiboBio公司)的轉染。6 h后更換新鮮培養基進行后續實驗。

1.2.4 Cell Counting Kit-8(CCK-8)測定細胞活性 使用CCK-8(日本Dojindo公司)測定細胞活性，首先將空白組、NC干擾組及ZFAS1干擾組3組細胞以1×104的密度均勻接種于96孔板中(每組設置4個復孔)，連續4 d相同時間測定細胞450 nm波長下的OD值以評估細胞活性。

1.2.5 細胞劃痕實驗 使用記號筆和尺子在6孔板背面適當地畫出水平線，將細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，進行轉染48 h后使用移液槍頭垂直于先前畫的水平線畫3條互相平行的垂直線，隨后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗細胞3次，去除脫落細胞，加入無血清培養基，放回培養箱繼續孵育。分別于0 h和48 h取標本拍照進行分析。

1.2.6 細胞凋亡檢測 采用膜聯蛋白V(annexin-V)-異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)測定細胞凋亡水平。將細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，轉染48 h后按照說明書收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，使用FlowJo軟件進行數據分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因 將Eca-109細胞均勻接種于培養板中過夜培養，并將pmirGLO-ZFAS1-wt(野生型)或pmirGLO-ZFAS1-mut(突變型)熒光素酶報告基因質粒和miR-302b-3p模擬物(miR-302b-3p mimics)或miR-302b-3p抑制物(miR-302b-3p inhibitor)轉染入細胞。用雙熒光素酶報告基因分析系統檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western蛋白印跡法 利用RIPA強裂解液(上海碧云天公司)裂解提取蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白條帶，隨后將蛋白轉移至PVDF膜(美國Millipore公司)，封閉后進行一抗c-Jun氨基末端激酶2(c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2)、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)、白細胞介素-1受體相關激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)和上皮細胞激酶(epithelial cell kinase 2,EphA2)(均購自美國Abcam公司，編號分別為ab178953、ab182408、ab5985、ab78002)孵育。GAPDH(ab128915，購自美國Abcam公司)作為內參蛋白。

2 結果

2.1 ZFAS1在ESSC組織和細胞中的表達 與癌旁組織相比，ZFAS1在食管癌組織中表達明顯上調(t=19.40,P<0.001，圖1A)。與正常食管上皮細胞Het-1A相比，食管癌細胞Eca-109中的ZFAS1表達水平顯著增高(t=13.80,P<0.001，圖1B)。

圖1 ZFAS1在食管癌組織及細胞中表達

2.2 干擾ZFAS1表達抑制ESSC細胞增殖 與NC干擾組細胞相比，ZFAS1干擾組細胞的ZFAS1表達水平顯著降低(t=15.53,P<0.001),空白組與NC干擾組比較沒有統計學意義(t=2.065,P>0.05，圖2A)。采用CCK-8檢測不同轉染組細胞的增殖活性，與NC干擾組細胞相比，48、72及96 h測得ZFAS1干擾組細胞增殖活性顯著降低，差異具有統計學意義(t值分別=2.933,8.568,10.04,P<0.05)，而24 h時沒有明顯差異(t=0.1960,P>0.05)?？瞻捉M與NC干擾組比較無統計學差異(t值分別=1.434,1.260,0.1761,0.4214,均P>0.05，圖2B)。

圖2 ZFAS1干擾對食管癌細胞增殖的作用

2.3 干擾ZFAS1抑制ESSC細胞遷移 與NC干擾組細胞相比，ZFAS1干擾組細胞的遷移率顯著降低，差異均有統計學意義(t=13.96,P<0.001)，空白組和NC干擾組相比較，細胞遷移能力無明顯變化(t=0.6948,P>0.05，圖3)。

圖3 ZFAS1-siRNA對食管癌細胞遷移的作用(×40)

2.4 ZFAS1-siRNA促進ESSC細胞凋亡 空白組和NC干擾組相比較，細胞凋亡率無明顯變化(t=0.4741,P>0.05)。與NC干擾組細胞相比，轉染ZFAS1干擾細胞的凋亡率顯著升高，差異具有統計學意義(t=10.68,P<0.001，圖4)。

圖4 干擾ZFAS1表達對食管癌細胞凋亡的影響

2.5 miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點 ZFAS1中存在能夠與miR-302b-3p結合的序列，圖5A。熒光素酶報告基因結果證實miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點(t=2.925,P<0.05，圖5B)。而且ZFAS1可以通過ceRNA的方式調控miR-302b下游靶基因JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2的表達，圖5C。

圖5 ZFAS1靶向miR-302b-3p對JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2表達的調控作用

3 討論

越來越多研究顯示，哺乳動物基因組編碼了大量長度超過200個核苷酸，蛋白質編碼能力有限的LncRNA，這些LncRNAs長度超過200個核苷酸，具有有限的蛋白質編碼能力[9]。近年來，有研究發現可產生LncRNA的蛋白質編碼基因中有18%與癌癥有關，而所有人類蛋白質編碼基因中僅有9%與癌癥有關[10]。鑒于LncRNAs在基因表達調控中的重要作用，且參與細胞增殖、凋亡、分化等多種活動，因此大量研究圍繞LncRNAs在癌癥病理過程的作用展開[11]，識別和研究與癌癥相關的LncRNAs對于理解LncRNAs在癌癥進展中的作用至關重要，并可能對發現新的治療靶點發揮重要作用。

ZFAS1是一種新近發現的LncRNA[12]。最近的證據表明ZFAS1在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用[13-17]。例如，ZFAS1在乳腺癌[13]、結直腸癌[14,17]、胃癌[15-16]中均有表達改變。此外，ZFAS1的表達與肺癌[18]、結直腸癌[14]、胃癌[15]患者的預后相關。目前罕有關于ZFAS1與食管癌的報道，Shi等[19]發現ESCC組織中的ZFAS1表達明顯高于相應的鄰近正常組織，且高ZFAS1表達的ESCC患者總體生存率較低，本研究結果與Shi等的發現一致。本研究通過qRT-PCR檢測正常食管細胞及食管癌細胞的ZFAS1表達水平，發現食管癌細胞表達ZFAS1水平較正常細胞高。此外，通過干擾Eca-109細胞表達ZFAS1，該細胞的增殖、遷移能力受到明顯抑制，且凋亡率升高。以上結果提示ZFAS1在食管癌的進展過程中發揮了促進作用。

近期有研究發現LncRNA可通過靶向內源性RNA發揮作用，即LncRNA可能作為競爭miRNA的競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)，從而負調控miRNA的表達[20]。Xu等[21]發現LncRNADANCR可作為一個ceRNA在膠質瘤中通過靶向miR-634調控RAB1A的表達。Gao等[22]發現LncRNA FLVCR1-AS1通過靶向miR-573上調E2F3的表達，促進肺癌的增殖和侵襲。為研究ZFAS1作用食管癌的潛在機制，本研究首先通過Starbase數據庫預測發現，ZFAS1中存在能夠與miR-302b-3p結合的序列，隨后用熒光素酶報告基因結果證實miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點。miR-302基因簇首先發現于人類胚胎干細胞，包括miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和miR-367。近年來，miR-302簇已被證明在癌細胞的增殖、分化及其致瘤性中發揮重要作用[23]。目前關于miR-302b-3p的研究較少，Tan等[24]發現過表達miR-302b-3p可通過直接靶向JNK2基因在加速皮膚衰老過程中發揮重要的生物學作用；Guo等[25]發現miR-302b-3p可靶向作用IGF-1R抑制胃癌細胞增殖。此外有研究證實IRAK4和EphA2同樣是miR-302b-3p的作用因子。本研究在證實miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點后，分別檢測空白組、ZFAS1干擾組及ZFAS1干擾+miR-302b-3p抑制劑組的JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2蛋白表達變化，結果顯示與空白組相比，ZFAS1干擾組的4個蛋白均表達減少，但添加miR-302b-3p抑制劑可逆轉此效應，說明ZFAS1在食管癌細胞中通過miR-302b-3p調控JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2。

綜上所述，本研究證實ZFAS1是食管癌的一個新的潛在致癌基因，它可通過促進細胞增殖、遷移及抑制凋亡發揮作用。本研究還發現ZFAS1可以通過ceRNA的方式調控miR-302b-3p下游靶基因JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2的表達。對參與ZFAS1介導的細胞增殖、遷移及凋亡反應的上下游調控機制尚不清楚。本研究的發現可能為揭示ZFAS1在食管癌發生發展中的作用機制提供新線索，并為食管癌的治療提供新方向。