基于中藥血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究進(jìn)展

崔素華，梁 楓，張 瑞，黃維琳

（安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽 蕪湖 241000）

1984年，日本學(xué)者Hiroko Iwama在對(duì)漢方藥的研究過程中首次提出“血清藥理學(xué)”和“血清藥物化學(xué)”這兩個(gè)重要概念，對(duì)藥物物質(zhì)基礎(chǔ)研究的系統(tǒng)化和規(guī)范化具有里程碑式的意義。由于中藥及中藥復(fù)方成分復(fù)雜，若直接加入體外反應(yīng)體系，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)與體內(nèi)作用機(jī)制有所不同，且藥物必須經(jīng)過血液循環(huán)才能起作用（腸道直接起作用及外用藥除外）。因此，我國(guó)學(xué)者提出了“中藥血清藥理學(xué)”和“中藥血清藥物化學(xué)”這兩個(gè)概念，目的是為了探明中藥入血起效的成分。血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)是兩個(gè)不同的研究領(lǐng)域，但它們之間又密切相關(guān)。在含藥血清中，藥物的化學(xué)成分與其藥理效應(yīng)是緊密相關(guān)的。因此，研究藥物化學(xué)成分的本質(zhì)及其藥理效應(yīng)，對(duì)促進(jìn)藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的發(fā)展具有重要意義[1]。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者逐漸將血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)的研究運(yùn)用到中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究體系。研究中藥藥效的化學(xué)成分以及明確不同成分的藥理效應(yīng)，是關(guān)系到中藥臨床應(yīng)用安全的關(guān)鍵因素，也是制約中藥現(xiàn)代化及國(guó)際化發(fā)展的關(guān)鍵問題[2]。血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)概念的提出與完善，以及化學(xué)分析手段的進(jìn)步，有助于推動(dòng)中藥現(xiàn)代化研究的進(jìn)一步發(fā)展。

1 中藥血清藥理學(xué)研究進(jìn)展

中藥血清藥理學(xué)的研究方法與傳統(tǒng)藥物體外研究有所不同，它是指中藥或中藥復(fù)方在動(dòng)物體內(nèi)吸收及作用一定時(shí)間后，采集、分離動(dòng)物血清，將含藥血清作為藥物直接加入體外反應(yīng)體系，用體外模型進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)的方法。通過模擬藥物在體內(nèi)的吸收和代謝反應(yīng)過程，研究其藥效及作用機(jī)制，既能減少中藥粗制劑對(duì)體外實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的干擾，又符合中藥經(jīng)機(jī)體消化吸收、生物代謝后產(chǎn)生藥理效應(yīng)的生理過程[3]。

1.1 含藥血清的制備

1.1.1 動(dòng)物選擇 邢作英等[4]認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇上應(yīng)注重制備血清的動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)所用離體器官、組織、細(xì)胞種屬保持一致。血清成分十分復(fù)雜，不同種屬的血清成分可能因在理化、生物等方面的差異以及免疫排斥反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，選擇合適的動(dòng)物模型以及相應(yīng)的體外反應(yīng)體系，能更準(zhǔn)確地反映藥物在機(jī)體內(nèi)的生物過程與藥物效應(yīng)。目前，含藥血清主要來源于大鼠、豚鼠、家兔等。張聲鵬等[5]報(bào)道在生理或病理狀態(tài)下，機(jī)體對(duì)藥物作用的反應(yīng)不同，分離出的含藥血清成分及含量也有所差異。因此，含藥血清的制備不僅要選擇合適的動(dòng)物模型，還要考慮生理狀態(tài)的影響。

1.1.2 給藥、取血方案 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥途徑多樣，其中灌胃給藥是常見給藥途徑，其對(duì)機(jī)體傷害小，操作簡(jiǎn)單，被廣泛運(yùn)用。張宏等[6]在研究中提出使用以下公式作為灌胃給藥量參考：每日給藥量＝成人日用量/成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量×人與動(dòng)物等效劑量換算倍數(shù)/培養(yǎng)基中含藥血清濃度。實(shí)踐過程中，最常用的是以臨床等效關(guān)系為參考，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳給藥劑量。李儀奎等[7]提出以每天給藥兩次，連續(xù)給藥3天，末次給藥一小時(shí)后采血制備含藥血清的通用實(shí)驗(yàn)方案，但也有學(xué)者提出采血時(shí)間不必局限于傳統(tǒng)方法，可根據(jù)具體情況而定。含藥血清的采集可以選擇大鼠股動(dòng)脈或下腔靜脈采血法、家兔耳緣靜脈或頸動(dòng)脈采血法等[8]。

1.2 含藥血清的處理及保存

血清成分復(fù)雜，含有多種微量活性物質(zhì)，包括酶、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等，這些活性物質(zhì)在進(jìn)入體外反應(yīng)體系后，對(duì)結(jié)果造成的影響往往難以評(píng)估，因此在加入前，應(yīng)將含藥血清滅活，有助于減少非藥理性的干擾，也符合防止微生物感染的細(xì)胞培養(yǎng)要求[9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者用得比較多的是水浴滅活法。但也有學(xué)者認(rèn)為分離的含藥血清可以不滅活處理，因?yàn)橥ㄟ^設(shè)立空白對(duì)照組血清，可以比較含藥血清中藥物的藥理學(xué)效應(yīng)[10]。血清的保存對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣會(huì)有影響，國(guó)內(nèi)研究者依據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，一般采用-20℃的短期保存和-80℃長(zhǎng)期凍存。

1.3 中藥血清藥理學(xué)方法學(xué)研究

藥理學(xué)研究理念和方法的不斷完善是規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化中藥血清藥理研究的基礎(chǔ)。近年來，中藥血清藥理學(xué)方法成為中藥規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化研究的主要方法之一。魏元鋒等[11]在研究過程中提出，通過使用現(xiàn)代分析技術(shù)，包括液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等手段，分離、鑒定含藥血清中的不同成分，建立血藥成分的量效關(guān)系，是中藥血清藥理學(xué)藥效物質(zhì)研究的基礎(chǔ)。含藥血清實(shí)驗(yàn)方法的建立具有重要的臨床意義，其不僅有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)藥物的有效成分或有效部位，還可以為制備藥效明確的中藥制劑以及提高臨床療效和降低毒副作用提供更貼近實(shí)際的參考[12]。近年來，我國(guó)學(xué)者在中藥含藥血清藥理研究方面取得了一定進(jìn)展，并對(duì)研究方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的改進(jìn)[13]。

2 中藥血清藥物化學(xué)研究進(jìn)展

中藥物質(zhì)成分的分離和鑒定是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。血清藥物化學(xué)的提出，是對(duì)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要補(bǔ)充。血清藥物化學(xué)的研究是以從動(dòng)物體內(nèi)分離的含藥血清為樣品，以現(xiàn)代化的化學(xué)分析手段為基礎(chǔ)，綜合分析、鑒定含藥血清中的入血成分與代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)中藥入血后的有效物質(zhì)成分，以及不同成分、代謝產(chǎn)物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)[14]。將血清藥物化學(xué)運(yùn)用于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究，可以彌補(bǔ)血清藥理學(xué)難以鑒定有效作用物質(zhì)成分、排除血清固有成分干擾、測(cè)定藥物動(dòng)態(tài)代謝的缺陷。中藥血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)協(xié)同研究，推動(dòng)中藥研究向國(guó)際精準(zhǔn)化研究標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展[15]。目前，中藥血清藥物化學(xué)主要通過超高效液相色譜等現(xiàn)代化學(xué)分析手段，對(duì)比分析含藥血清與對(duì)照血清色譜指紋圖譜的差異，從而鑒定含藥血清中的原有成分、代謝產(chǎn)物或血清內(nèi)源性物質(zhì)。

2.1 單味中藥的血清藥物化學(xué)研究

由于中藥成分復(fù)雜，不同化學(xué)成分有多種藥理作用，即使是單味中藥也含有復(fù)雜的化學(xué)成分。因此，明確藥物的化學(xué)成分是至關(guān)重要的。吳賢波等[16]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）明確了烏梅藥材原型入血的成分有3種（齊墩果酸、熊果酸、苜蓿酸），入血后的代謝產(chǎn)物有10種。付燕偉等[17]采用液相色譜法（HPLC）技術(shù)明確了桑白皮的大鼠含藥血漿中有7個(gè)移行成分，鑒定入血原型成分桑皮苷A。李靜靜等[18]采用液相色譜法（HPLC）技術(shù)明確了川芎提取液灌胃后血中有7個(gè)入血成分，其中4個(gè)為代謝產(chǎn)物，3個(gè)為原型成分，川芎入血成分主要為川芎嗪和阿魏酸。梁華等[19]采用液相-固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）明確了用五味子提取物給大鼠模型灌胃后，其血清中所含主要原型成分為五味子醇甲、醇乙、甲素、乙素。邱楠楠等[20]采用超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-ESI-MS/MS）技術(shù)明確了用紫紅參提取物給大鼠灌胃后從大鼠含藥血清中檢測(cè)到了14種入血成分，其中6種為紫紅參提取物中原型吸收入血的成分，其余可能為代謝產(chǎn)物或機(jī)體吸收紫紅參后產(chǎn)生的應(yīng)激性成分。

2.2 復(fù)方中藥的血清藥物化學(xué)研究

中藥配伍使用是中醫(yī)臨床的一大特色，可以組合不同成分的中藥，通過不同成分的協(xié)同和拮抗，發(fā)揮協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)體的作用。但是因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，明確配伍使用的復(fù)方制劑中的有效成分和毒副作用也十分重要。唐崢等[21]采用超快速液相色譜技術(shù)（UFLC）明確了用梔子大黃湯給大鼠灌胃后大鼠血中有21個(gè)入血成分，其中12個(gè)為代謝產(chǎn)物，9個(gè)為原型成分，經(jīng)與對(duì)照品比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)原型入血成分分別為京尼平苷、蘆薈大黃素和大黃酸。郭輝等[22]通過液相色譜分析法發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)大黃附子湯灌胃后，分離的血清中含有18種入血化學(xué)成分，其中14種為機(jī)體代謝產(chǎn)物，4種為藥物原型成分。劉佳麗等[23]采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法（UPLC-PDA）明確了用逍遙散乙醇提取物的石油醚萃取物給大鼠灌胃后，血清中有20個(gè)入血成分，其中12個(gè)為原形成分，分別來源于柴胡（9個(gè)）、當(dāng)歸（2個(gè)）、白術(shù)（1個(gè)），另外8個(gè)為代謝產(chǎn)物。程健等[24]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）明確了通塞脈微丸中綠原酸、芹糖甘草苷、毛蕊異黃酮苷、木犀草苷、甘草苷、阿魏酸、異甘草苷、哈巴俄苷、甘草素和肉桂酸10種主要成分。

3 中藥血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)協(xié)同的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

安全性與有效性是中藥臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。明確中藥的有效成分及藥效評(píng)估一直是制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的難題。在中藥基礎(chǔ)研究過程中，竇志華等很早就提出以血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)為基礎(chǔ)的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，確立了中藥基礎(chǔ)研究的主要思路。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是指以血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)協(xié)同研究為基礎(chǔ)，運(yùn)用液相色譜分析法等方法明確含藥血清藥理效應(yīng)與指紋圖譜化學(xué)成分峰面積或藥源性成分含量的關(guān)聯(lián)性，闡明藥物成分及其藥理學(xué)效應(yīng)譜效、量效關(guān)系的研究方法[25]。

3.1 血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)的有機(jī)結(jié)合

安莉萍等[26]研究了復(fù)方五仁醇膠囊，通過血清指紋圖譜結(jié)合藥效評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)五味子、木脂素類成分與保肝作用相關(guān)，五味子單劑與復(fù)方五仁醇膠囊藥效評(píng)價(jià)相當(dāng)，指紋圖譜分析提示木脂素類成分是保肝作用的主要成分。田友清等[27]通過香青蘭醇及其含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的藥效評(píng)估，證實(shí)了香青蘭醇及其含藥血清具有缺氧/復(fù)氧損傷能力，提示香青蘭具有心肌保護(hù)作用。血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)的協(xié)同研究，不僅可以對(duì)藥物及其組分進(jìn)行藥理效應(yīng)評(píng)價(jià)，同時(shí)可以明確不同組分入血后的代謝過程，從而反映真實(shí)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 譜效、量效關(guān)系分析數(shù)據(jù)處理方法

人工匹配是物質(zhì)分析的基本方法，通過比較分析不同血清的二維分析圖譜，進(jìn)而鑒定出藥物入血后的移行成分。但是，人工匹配難度大，同一保留時(shí)間可能有多種流出物質(zhì)，容易造成數(shù)據(jù)浪費(fèi)。主成分分析是對(duì)傳統(tǒng)血清藥物化學(xué)研究方法的補(bǔ)充，其目的是將多指標(biāo)轉(zhuǎn)變成少數(shù)幾個(gè)綜合性指標(biāo)。吳賢波等[16]用主成分分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后確定了烏梅的入血成分及其代謝產(chǎn)物。隨機(jī)森林法是一種以分類樹為基礎(chǔ)的計(jì)算方法，可以預(yù)測(cè)多達(dá)幾千個(gè)解釋變量的作用[28]。徐丹[29]通過建立譜效關(guān)系，運(yùn)用隨機(jī)森林法發(fā)現(xiàn)多種頭花蓼提取物含藥血清，均具有抑制炎癥因子釋放的作用，其作用可能是通過促進(jìn)機(jī)體大量釋放某些具有抗炎作用的內(nèi)源性分子而達(dá)到的。以上3種方法中主成分分析法與人工匹配相比能更客觀、全面地分析藥材入血成分及其代謝產(chǎn)物。隨機(jī)森林法更加適用于大數(shù)據(jù)多分類變量的處理[30]。

4 思考與展望

近年來，中藥血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)相結(jié)合的方法被廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其藥理作用機(jī)制的研究中，血清藥物化學(xué)與血清藥理學(xué)的結(jié)合不僅有助于揭示中藥多組分多靶點(diǎn)協(xié)同藥效學(xué)的特點(diǎn)，而且有助于分析和比較血清中的移行成分并鑒定體內(nèi)直接作用物質(zhì)，是中藥藥效研究的物質(zhì)基礎(chǔ)[31]。

中藥血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)的提出，推動(dòng)了中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的進(jìn)程。但仍然存在很多問題，含藥血清的研究方法主要用于口服給藥，對(duì)非口服給藥以及口服不吸收僅作用于胃腸黏膜表面的藥效成分難以評(píng)價(jià)。同時(shí)，該方法的研究周期相對(duì)較長(zhǎng)[32]。含藥血清制備和滅活過程會(huì)使一部分重要化學(xué)成分損失或變化，而且含藥血清成分復(fù)雜，檢測(cè)、分離及富集有效單體也有一定困難[33]。所以，仍然有許多問題（如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否需要造模、給藥次數(shù)和采血時(shí)間、血清與血漿的選擇等）需要我們進(jìn)一步研究和探討。