5-甲基胞嘧啶
——高等生物的主要表觀遺傳標記

劉卓 潘攀

（張家港市第一人民醫院腫瘤科 江蘇 張家港 215600）

引言

DNA中堿基的化學修飾近年來一直是生命科學領域研究的熱點之一。主要的DNA修飾包括腺嘌呤的甲基化和脫氨基，胞嘧啶的甲基化、羥甲基化和羧基取代，鳥嘌呤的氧化等，雖然這些修飾堿基的比例較低，但它們或者是細胞的生理活動所必需的，或者與細胞的病理發生密切相關，而且在物種間具有高度保守性和獨特性[1]。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤及7-甲基鳥嘌呤[2]。其中，胞嘧啶第5位碳原子上的甲基化動態修飾研究得較為深入。在上世紀早期，科學家首次用實驗證明甲基化胞嘧啶是生物體內天然存在的化合物[3]，修飾之后的堿基稱為5-甲基胞嘧啶，簡稱為5mC。1951年，DNA中5mC的存在被Wyatt第一次報道[4]。

1.5mC和5hmC在基因表達調控中的基本作用

5mC是高等真核生物表觀遺傳修飾的主要形式，5hmC是5mC的羥基化形式，被稱為DNA的第6種堿基，它最早于1952年在噬菌體DNA中被發現，它能被糖基轉移酶介導糖基化修飾，從而使噬菌體基因組在進入宿主后能抵抗宿主限制酶的降解[5]。5hmC與5mC一樣參與基因表達調控。一系列成果證實Tet1蛋白能調控CpG富集啟動子處的DNA甲基化與羥甲基化水平，進而能促進干細胞中與多能性相關的因子的轉錄，使干細胞保持多能性[6]。為了具體探明甲基化與基因表達調控的關系，科學家在基因組層面測定了5mC和5hmC的存在位點[7]，結果表明5mC主要導致基因的沉默，5hmC主要導致基因的激活，這可能因為5hmC是基因去甲基化的先兆。

在基因啟動子區內CpG位點上，甲基化可能通過3種方式影響該基因轉錄活性[8]：

（1）DNA序列甲基化直接阻礙轉錄因子的結合。

（2）甲基CpG結合蛋白(methyl2CpG2bindingproteins,MB Ps)結合到甲基化CpG位點,與其他轉錄復合抑制因子相互作用或招募組蛋白修飾酶改變染色質結構。

（3）染色質結構的凝集阻礙轉錄因子與其調控序列的結合。

以上三種抑制轉錄的途徑均需要通過改變染色質構型來實現。目前已經證實，在CpG島上的DNA甲基化能夠改變染色質的構型[8]。在決定DNA構型的諸多參數中，DNA二級結構中大溝、小溝的寬度和深度參數對DNA－蛋白質、DNA－小分子結合有重要影響，如果這些參數改變，蛋白質或小分子的識別及與DNA結合的強度都會發生變化[10]。

2.5mC表觀遺傳修飾標記的優越性

2.1 生命活動的能量

BER通路是在原核生物中就已經存在的DNA修復機制，用于修復由于水解脫嘌呤、胞嘧啶及其衍生物的脫氨、鳥嘌呤的氧化、胞嘧啶和腺嘌呤特定位點上的甲基化等造成的單個堿基損傷[11]。然而在高等真核生物的基因表達調控中，這種修復機制卻被賦予了新的含義。可以看到以上所提的兩種已經被證實的去甲基化途徑中，均利用了這種堿基配對修復機制來實現甲基化與去甲基化之間的動態變化。這種運用已存在的通路實現新的生物學功能，拓展原有通路的方式，能夠節約生物體進行基本生命活動所需的能量。例如，如果細胞要建立一個主動去甲基化的新通路，假設原有通路的蛋白及其他小分子對新通路沒有任何作用，那么新通路需要生物體合成全新的蛋白質和小分子，效率明顯不如拓展原有通路高。

就5-甲基胞嘧啶而言，進一步脫氨或氧化均可以啟動BER通路，即可運用已有的胸腺嘧啶-DNA糖苷酶切除甲基化的胞嘧啶，實現去甲基化。

2.2 對細胞正常穩態的影響

相比于胞嘧啶脫氨基、鳥嘌呤氧化和發生在堿基其他不同位點的甲基化等化學修飾而言，5mC修飾的優勢在于不影響DNA的一級結構，主要通過影響二級結構來影響基因表達，不影響堿基配對和DNA的穩定性，不會對生物體造成明顯的危害。

前文中已提到，在CpG島上的DNA甲基化能夠改變染色質的構型。甲基化通過改變DNA二級結構中大溝、小溝的寬度和深度參數，影響蛋白質或小分子的識別及與DNA結合的強度。同時，對C5-MeC…G的電子占據數和授受體作用的二級微擾能量E2進行分析，可以看到，胞嘧啶5-C位甲基化沒有改變GC 堿基間的氫鍵授受體作用方式，對G…C堿基間的氫鍵結合沒有顯著影響，不影響堿基配對，故不會降低DNA的穩定性。隨著去甲基化的進行，這種對蛋白質或小分子的影響隨之消除，具有高度的可逆性和無損傷性。

此外，如圖所示，胞嘧啶可以在亞硫酸根的介導下實現脫氨基，從而生成尿嘧啶，造成基因突變。研究表明，5mC具有抵抗各種亞硫酸氫根介導的脫氨基作用的能力，這一特性被用于檢測全基因組中5mC的存在[12]。

因此胞嘧啶的甲基化修對于遺傳信息的保存沒有影響，不影響堿基配對，不具有毒性，甚至能夠一定程度上抑制C→U的基因突變，是一種理想的表觀遺傳標記。

特別需要提到的是，另一種化學修飾，6-甲基腺嘌呤，它在原核生物中是限制性修飾系統的重要標記，使得自身DNA不和外源DNA一樣被降解，除此之外，6-甲基腺嘌呤還能起到重要的調控作用，具有成為新的表觀遺傳修飾的潛能[13]。

下面筆者總結了其他常見化學修飾對細胞的影響：

（1）如果把胞嘧啶脫氨基作用作為表觀遺傳標記，則生成尿嘧啶，改變了遺傳信息，甚至不可稱作表觀遺傳修飾，不可行。

（2）如果把鳥嘌呤氧化作用作為表觀遺傳標記，那么鳥嘌呤氧化生成的8-氧鳥嘌呤不僅能夠與腺嘌呤配對，導致復制后堿基序列出錯，不利于遺傳信息精確地傳遞，還具有毒性[14]，不適宜在機體內作為表觀遺傳標記以一定數量存在。

（3）N3-甲基腺嘌呤可以阻止DNA的正常復制；N1-甲基腺嘌呤和N3-甲基胞嘧啶會阻止堿基對的形成；O6-甲基鳥嘌呤和O4-甲基胸腺嘧啶可能引起基因突變[15]。以上修飾均對細胞具有很大的毒性。

以上這些修飾都是不適于作為表觀遺傳標記的。綜上，5mC相比于其他修飾具有明顯的優越性，筆者推測這也是5mC成為高等真核生物的主要表觀遺傳標記的原因。

[1]Yi, C., & Pan, T. (2011). Cellular dynamics of rna modification. Accounts of Chemical Research, 44(12),1380-8.

[2]Dodge, Jonathan E.; Bernard H. Ramsahoyeb,Z. Galen Woa,Masaki Okanoa, En Li:De novo methylation of MMLV provirus in embryonic stem cells: CpG versus non-CpG methylation(2002)Gene,289(1-2):41-8.

[3]Treat Baldwin Johoson, Robert D. Coghill.

[4]Wyatt, G.R. (1951)Recognition and estimation of 5-methylcytosine in nucleic acids. Biochem. J. 48, 581-584.

[5]COHEN, S. S., & WYATT, G. R. (1952).A new pyrimidine base from bacteriophage nucleic acids. Nature, 170(4338),1072-1073.

[6]Ito, S., D'Alessio, A.,C., Taranova, O. V., Hong, K.,Sowers, L. C., & Zhang, Y. (2010). Role of tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature, 466(7310), 1129-33.

[7]Kriaucionis, S., & Heintz, N. (2009). The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in purkinje neurons and the brain. Science, 324(5929), 929-930.

[8]Attwood JT；Yung RL；Richardson BC(2002)DNA methylation and the regulation of gene transcription. CellMo. 59(2):241-257.

[9]F. Antequera, J.Boyes: High levels of De Novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines.A Bird-Cell, 1990.Volume 62,Issue 3,10 August 1990, Pages 503-514.

[10]Remo R, Ean M, Sean M. West, Alona Sosinsky, Peng Liu,Richard S. Mann, B Honig :The role of DNA shape in protein － DNA recognition［J］. Nature,2009,461:1248-1253．

[11]Lindahl, T. (2013): My journey to DNA repair. Genomics、Proteomics & Bioinformatics, 11(1),2-7.

[12]Yu, M.; Hon, G. C.; Szulwach, K. E. … Jin, P.*; Ren, B.*;He, C.* Cell 2012, 149, 1368-1380.Also see oxBS-Seq in Science 2012, 336, 934.

[13]Luo, G., Blanco, M., Greer, E., He, C., & Shi, Y.(2015). DNA N-6-methyladenine: A new epigenetic mark in eukaryotes? Nature Reviews Molecular Cell Biology, 16(12),705-710.

[14]Bret D. Freudenthal, William A. Beard, Lalith Perera,David D. Shock, Taejin Kim, Tamar Schlick & Samuel H.Wilson，Uncovering the polymerase-induced cytotoxicity of an oxidized nucleotide，Nature517,635-639

[15]Thomas E S，Douglas E L. Structure of the hydrogen bonding complex of O6-methylguanine with cytosine and thymine during DNA replication［J］. Nucleic Acids Research，1997，25(16):3354-3361．