結腸癌組織中SDC1蛋白的表達變化及意義

聶向榮，武劍磊，武永慶

1邯鄲市中心醫院,河北邯鄲056001;2武安市第一人民醫院

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來，其發病率、病死率隨人口老齡化及飲食習慣改變呈上升趨勢[1]。結腸癌侵襲和轉移是導致患者生存率降低的重要原因，尋找結腸癌侵襲和轉移相關的靶分子是目前研究重點。鈣黏蛋白是定位于細胞膜上的鈣依賴性跨膜蛋白，其異常表達與腫瘤細胞侵襲有關。上皮間質轉化標志物上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達下降，神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)表達增加，使上皮細胞極性消失，轉化為間充質細胞，從上皮組織分離或脫落至其他部位，進而誘發腫瘤細胞侵襲和轉移[2]。多配體蛋白聚糖1(SDC1)又名CD138，是進化保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)家族的重要成員之一，主要在上皮細胞中表達，在細胞增殖、分化、黏附等過程中發揮調控作用[3]。SDC1蛋白定位于細胞表面，其異常表達與神經膠質瘤[4]、乳腺癌[5]的發生、不良預后關系密切。2012年1月—2014年8月，我們采用免疫組化法檢測了結腸癌患者癌組織及癌旁正常組織中SDC1蛋白表達，探究其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年1月—2014年8月入住我院并行手術切除的130例結腸癌患者的癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤組織>5 cm)的石蠟樣本，患者男66例、女64例，年齡(45.79±6.27)歲，其中<60歲者71例，≥60歲者59例。腫瘤直徑<5 cm者76例，≥5 cm者54例；組織分化程度：中高分化95例，低分化35例；腫瘤浸潤深度T1+T243例，T3+T487例；淋巴結轉移49例，遠處轉移42例；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期79例，Ⅲ期+Ⅳ期51例。病例入選標準：患者或其家屬簽署知情同意書；有完整的病歷資料和隨訪資料；術后經病理學檢查確診為結腸癌(腺癌)；術前未接受放化療。排除標準：合并其他惡性腫瘤；肝、膽、腎等重要器官功能不全；患有家族性腺瘤性息肉病。以患者出院為隨訪起點，采用電子通信或門診復診的方式，對患者進行為期1～60個月的隨訪，直至隨訪時間結束或患者死亡，隨訪截止日期為2019年10月。本研究經邯鄲市中心醫院倫理委員會審核批準。

1.2 SDC1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取組織石蠟標本，常規脫蠟至水(3次二甲苯，3次乙醇)。采用通用型SP檢測試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)：滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH 6.0)，加熱至100 ℃，持續10 min，進行抗原修復，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；滴加封閉液(正常山羊血清)，37 ℃封閉10 min，棄血清；分別滴加SDC1(sc-12765，美國Santa Cruz公司)、E-cadherin(sc-21791，美國Santa Cruz公司)、N-cadherin(sc-59987，美國Santa Cruz公司)一抗工作液，4 ℃孵育過夜，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；滴加新鮮配制的DAB溶液，進行顯色反應，蒸餾水清洗；蘇木素溶液復染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。

結果判定[6]：SDC1蛋白、E-cadherin蛋白及N-cadherin蛋白均主要定位于細胞膜。光學顯微鏡下(CX31，日本Olympus公司)，隨機選取10個視野，每個視野計數100個腫瘤細胞。陽性細胞百分比：<5%為0分，5%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%為4分；著色強度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分與著色強度評分的乘積進行結果判定，二者乘積5～12為陽性表達，0～4為陰性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS24.0統計軟件。計數資料采用百分比表示，兩樣本間陽性率的比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關分析兩等級指標間的相關關系，Kaplan-Meier生存模型、Log-rank檢驗分析SDC1蛋白表達對結腸癌患者預后的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織及癌旁正常組織中SDC1蛋白表達比較 免疫組化結果顯示，結腸癌組織中SDC1蛋白陽性表達率為22.31%(29/130)，癌旁正常組織中SDC1蛋白陽性表達率為91.54%(119/130)，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 結腸癌組織中SDC1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 結腸癌組織中，SDC1蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑無關(P均>0.05)，與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期相關(P均<0.05)，見表1。

2.3 結腸癌組織中SDC1蛋白表達對患者預后的影響SDC1蛋白陰性表達101例(SDC1蛋白陰性表達組)，SDC1蛋白陽性表達29例(SDC1蛋白陽性表達組)。SDC1蛋白陰性表達組術后5年總生存率為51.49%(52/101)，SDC1蛋白陽性表達組術后5年總生存率為79.31%(23/29)，Log-rank檢驗結果顯示，兩組預后比較差異有統計學意義(χ2=5.494，P=0.019)。

2.4 結腸癌組織SDC1蛋白表達與E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的關系 結腸癌組織中E-cadherin蛋白陽性表達率為26.15%(34/130)，N-cadherin蛋白陽性表達率為70.77%(92/130)。SDC1蛋白陰性表達者E-cadherin陰性表達72例，陽性表達29例；SDC1蛋白陰性表達者N-cadherin陰性表達15例，陽性表達86例。SDC1蛋白陽性表達者E-cadherin陰性表達24例，陽性表達5例；SDC1蛋白陽性表達者N-cadherin陰性表達23例，陽性表達6例。Spearman等級相關分析結果顯示，結腸癌組織中SDC1蛋白表達與E-cadherin表達呈正相關(rs=0.753，P=0.016)，SDC1蛋白表達與N-cadherin表達呈負相關(rs=-0.682，P=0.028)。

3 討論

結腸癌患者早期癥狀不明顯，但隨病情進展、腫瘤體積增加，患者表現為便秘、腹瀉、便血、局部腹痛，后期則出現腰部疼痛、腸梗阻癥狀，嚴重影響患者日常生活、威脅患者生命安全[7]。近年來，隨著靶向化療藥物的臨床應用，患者臨床癥狀得到顯著緩解[8]，但因結腸癌具有易侵襲、轉移等惡性生物學行為，導致患者預后較差。

腫瘤細胞侵襲和遷移是多因素、多步驟、多階段的復雜過程。SDC1蛋白屬于黏附分子，可促進細胞與細胞外基質(ECM)、細胞與細胞間相互作用，SDC1蛋白表達減少或缺失可促進腫瘤生長、侵襲和轉移[9]，如轉錄因子E盒鋅指蛋白1(ZEB1)抑制SDC1基因表達，進而促進前列腺癌侵襲[10]，Schneider等[11]證實，miR-10b靶向SDC1基因表達，降低SDC1蛋白表達，促進IL-6分泌、增加基質金屬蛋白酶9表達，進而促進細胞黏附、遷移、新生血管生成。Ibrahim等[12]研究發現，SDC1可作為三陰性乳腺癌分子標志物，且可作為患者的治療靶標。

本研究免疫組化結果顯示，SDC1蛋白主要定位于細胞膜，且結腸癌組織中SDC1蛋白表達陽性率低于癌旁正常組織，此外，癌組織中SDC1蛋白表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移有關。以上結果初步表明SDC1蛋白具有腫瘤抑制功能，SDC1蛋白低表達能誘發結腸癌形成，且可能通過減弱結腸癌細胞間黏附進而促進癌細胞對周圍組織浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移。新生血管形成是腫瘤侵襲轉移的關鍵，SDC1蛋白可能參與調控血管生成擬態。Andersen等[13]證實,多發性骨髓瘤中SDC1高表達與腫瘤血管生成相關。

研究證實，上皮間充質轉化是腫瘤細胞侵襲和遷移的關鍵，其特征性改變為緊密連接蛋白E-cadherin表達缺失，間質相關蛋白N-cadherin表達增加[14,15]。本研究Spearman等級相關分析結果顯示，結腸癌組織中SDC1蛋白表達與E-cadherin蛋白表達呈正相關，而與N-cadherin蛋白表達呈負相關，表明在結腸癌細胞侵襲過程中，SDC1蛋白與E-cadherin蛋白發揮協同作用，但SDC1蛋白拮抗N-cadherin蛋白作用，初步證實SDC1蛋白低表達促進結腸癌細胞侵襲，且可能參與E-cadherin、N-cadherin蛋白表達調控。此外，已有研究證實SDC1是基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)的底物之一，在維持黏膜屏障功能等方面發揮重要作用[16]，這可能是SDC1蛋白參與腫瘤細胞侵襲的調控機制之一。筆者推測，基質金屬蛋白酶(MMP)除可降解ECM外，還可作用于SDC1蛋白，降低SDC1蛋白表達，而細胞膜蛋白間相互作用，導致E-cadherin蛋白表達降低，而N-cadherin蛋白表達增加，以上機制共同發揮作用，促進結腸癌細胞侵襲。后續將在細胞水平證實以上科學假設，探究SDC1蛋白分子的調控機制。

Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，SDC1蛋白陰性表達組術后5年總生存率低于SDC1蛋白陽性表達組，且SDC1蛋白低表達與TNM高分期相關，提示SDC1蛋白低表達與結腸癌患者低生存率有關。Binder等[17]在結腸癌小鼠模型中發現，SDC1蛋白表達缺失可預示結腸癌惡性進展。以上研究表明SDC1蛋白低表達具有預測患者病情惡化、不良預后的潛能。然而，本研究樣本量有限，有待大樣本進一步驗證。

綜上所述，結腸癌組織中SDC1蛋白呈低表達，且與患者病情惡性進展、預后不良有關；SDC1蛋白表達下降可降低E-cadherin蛋白表達、增加N-cadherin蛋白表達，誘發上皮間充質轉化過程，進而促進侵襲和轉移。