雷帕霉素通過mTORC1/HIF-1α信號調控人骨肉瘤細胞凋亡

王華磊，葉向陽，湯立新

研究證實哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與人骨肉瘤細胞侵襲性密切相關[1-2]。文獻報道,miR-144可抑制人骨肉瘤MG63細胞mTOR的活性，進而抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，而mTOR抑制劑雷帕霉素能夠顯著增加人骨肉瘤MG63細胞凋亡[3-4]。缺氧誘導因子(HIF)-1α被報道與骨肉瘤患者的預后不良呈正相關[5]。骨肉瘤組織內部常處于缺氧狀態，HIF-1α表達上調，促進骨肉瘤細胞的遷移[6]。有學者認為HIF-1α和mTOR相互作用是選擇性小分子抑制劑治療頭頸部鱗狀細胞癌的新型靶點[7]。缺氧條件下，侵襲性前列腺癌細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路活化，同時過表達HIF-1α，而mTOR抑制劑抑制mTOR活化，同時顯著下調HIF-1α表達，進而降低前列腺癌細胞的侵襲能力[8]。但是，mTORC1/HIF-1α信號是否在骨肉瘤細胞中發揮重要的調控作用未查到文獻報道。本研究探討缺氧條件下雷帕霉素對人骨肉瘤MG63細胞凋亡的影響，為骨肉瘤的進一步研究提供新的理論依據，也為骨肉瘤的臨床有效治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器人骨肉瘤細胞系MG63(ATCC細胞庫)；RPMI1640培養基、胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、化學發光(ECL)液(上海碧云天生物公司)；雷帕霉素(上海阿拉丁生化科技公司)；si-RNA轉染試劑盒(Invitorgen公司)；兔抗人結節性硬化癥(TSC)1抗體、兔抗人p-S6抗體、兔抗人Bax抗體、鼠抗人Bcl-2抗體、抗鼠二抗、抗兔二抗(Cell Signaling公司)；鼠抗人S6抗體、鼠抗人HIF-1α抗體、兔抗人β-actin抗體、熒光抗鼠二抗-AF488(Abcam公司)；凋亡檢測試劑盒(天津三箭生物公司)；流式細胞儀(BD公司)；細胞培養箱和缺氧培養箱(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實驗方法本實驗在南陽醫學高等專科學校實驗室獨立完成。

1.2.1細胞培養 復蘇人骨肉瘤MG63細胞，10%胎牛血清RPMI1640培養基在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中傳代培養，待細胞融合率達80%時收集細胞。培養基重懸細胞，按1×105/ml濃度接種到6孔板中繼續培養。

1.2.2流式儀檢測細胞凋亡 將1.2.1中培養的細胞接種到6孔板后，分為常氧組、缺氧組(在2% O2，95% N2的缺氧培養箱中培養)和缺氧+雷帕霉素組。孵育24 h后，缺氧+雷帕霉素組加入0.1 nmol/L雷帕霉素，其余兩組加入等量雷帕霉素的溶劑二甲基亞砜(DMSO)，繼續孵育48 h。收集人骨肉瘤MG63細胞至離心管中，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后離心。倒去上層液再加入PBS均勻混合，使用凋亡試劑盒，加入1×Binding Buffer使細胞濃度為1 × 106/ml，取100 μl加入EP管中，再加入5 μl FITC-Annexin V以及10 μl PI，室溫下避光15 min，最后加入400 μl 1×Binding Buffer。

1.2.3細胞免疫熒光檢測HIF-1α蛋白表達 人骨肉瘤MG63細胞融合率達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化后收集于15 ml離心管中，800 r/min離心5 min。沉淀用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸，然后將少量細胞混懸液加入中心帶有玻片的6孔培養板中，分為常氧組、缺氧組和缺氧+雷帕霉素組。處理72 h，細胞生長到約60%密度，棄去上清液，PBS浸洗玻片3次，2%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS浸洗3次，0.5% Triton X-100的PBS室溫通透20 min，PBS浸洗3次，吸水紙吸干。再滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，依次加HIF-1α(1 ∶100)一抗和對應的熒光二抗(1 ∶200)。孵育結束后，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4si-RNA干擾技術沉默TSC1和HIF-1α的表達 ① 沉默TSC1、HIF-1α：選擇生長狀態良好的人骨肉瘤MG63細胞傳代至6孔培養皿中，缺氧條件下進行過夜培養。待細胞處于對數生長期，細胞融合密度達60%～70%時，采用si-RNA轉染試劑盒進行轉染。轉染4 h后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養至48 h，然后放入缺氧培養箱(含2% O2，95% N2)中繼續培養24 h，立刻提取細胞總蛋白做后續檢測。si-RNA序列：TSC1：CCA AAUCUCAGCCCGCUUUTT；HIF-1α：GCCUCUGAUA AAGGCAACUTT，設置陰性對照組。實驗分為陰性對照組(NC組)、沉默TSC1組(si-TSC1組)、沉默HIF-1α組(si-HIF-1α組)和同時沉默TSC1/ HIF-1α組(si-TSC1+HIF-1α組)。② 過表達HIF-1α：按照文獻[9]，構建HIF-1α基因的慢病毒過表達載體質粒，慢病毒法感染MG63細胞并篩選得到HIF-1α過表達的MG63細胞。HIF-1α基因序列：上游:3′-GA GGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGAGGGCG CCGGCGGCGCGAACGA-5′；下游:3′-TCACCATGGT GGCGACCGGGTTAACTTGATCCAAAGCTCTG-5′，序列中斜體加粗處為表達增強序列，下劃線處為 Age I酶切位點。將未導入HIF-1α基因序列的空質粒組作為空載體組，實驗分為空載體組、雷帕霉素+空載體組和雷帕霉素+過表達HIF-1α組。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 人骨肉瘤MG63細胞融合率達90%后收集并裂解細胞，提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度；按照不同樣品蛋白濃度取不同體積的蛋白樣品(總質量30 μg)，經10% SDS-PAGE電泳分離；轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉的TBS-T封閉；加入TSC1(1 ∶2 000)、p-S6(1 ∶3 000)、S6(1 ∶4 000)、HIF-1α(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶3 000)等Ⅰ抗及辣根過氧化物酶(HRP)標記Ⅱ抗，采用ECL法曝光顯影。

2 結果

2.1 雷帕霉素在缺氧條件下對人骨

肉瘤MG63細胞凋亡的影響流式儀檢測各組細胞凋亡率：常氧組為5.22%～6.78%(6.00%±0.78%)；缺氧組為4.64%～5.62%(5.13%±1.33%)；缺氧+雷帕霉素組為16.34%～19.00%(17.67%±0.49%)。與常氧組、缺氧組比較，缺氧+雷帕霉素組細胞凋亡率顯著增加(P<0.001)；常氧組與缺氧組細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 雷帕霉素在缺氧條件下對人骨肉瘤MG63細胞mTORC1活性的影響Western blot檢測細胞mTORC1活性指示蛋白p-S6蛋白的表達。與常氧組比較，缺氧組細胞p-S6蛋白表達顯著上調，但缺氧+雷帕霉素組細胞p-S6蛋白表達顯著下調。見圖2。

2.3 雷帕霉素在缺氧條件下對人骨肉瘤MG63細胞HIF-1α表達的影響免疫熒光檢測細胞HIF-1α表達的結果顯示：與常氧組比較，缺氧組細胞HIF-1α表達顯著上調，且向核內轉移；與缺氧組相比，缺氧+雷帕霉素組細胞HIF-1α表達顯著下調。見圖3。

2.4 雷帕霉素在缺氧條件下通過mTORC1/HIF-1α信號通路對人骨肉瘤MG63細胞凋亡相關蛋白的影響構建過表達HIF-1α的質粒，轉染人骨肉瘤MG63細胞的結果顯示：與空載體組比較，過表達HIF-1α組HIF-1α蛋白表達顯著增加，見圖4A。缺氧條件下，與空載體組比較，雷帕霉素+空載體組細胞HIF-1α表達顯著下調，促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調；與雷帕霉素+空載體組比較，雷帕霉素+過表達HIF-1α組細胞HIF-1α表達上調，同時Bax表達下降，Bcl-2表達上調，見圖4B。

用si-RNA方法分別沉默TSC1(mTORC1活化)和HIF-1α來證明mTORC1是否調節HIF-1α達到調控人骨肉瘤MG63細胞凋亡的目的。與NC組比較，si-TSC1組細胞mTORC1激活(p-S6蛋白表達上調)，HIF-1α蛋白表達增加，Bax蛋白表達下調，而Bcl-2蛋白表達上調；與NC組比較，si-HIF-1α組細胞mTORC1活性無顯著變化，Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調；與NC組比較，si-TSC1+HIF-1α組細胞mTORC1活性增強，但HIF-1α蛋白表達降低，Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調，見圖4C。

3 討論

骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，惡性程度高、轉移早，是兒童和青少年最常見的原發性惡性腫瘤。盡管可通過手術、放療、化療等方法治療骨肉瘤，但是其5年生存率仍然不足20%[1-2]。哺乳動物mTOR是細胞內重要的信號傳導途徑，在細胞增殖和凋亡過程中發揮關鍵性作用[2]。本研究以體外培養人骨肉瘤MG63細胞為模型，并模擬腫瘤細胞缺氧環境，誘導細胞HIF-1α表達，證明缺氧環境下人骨肉瘤MG63細胞過表達HIF-1α可能是細胞存活的重要保障。缺氧條件下人骨肉瘤MG63細胞mTORC1上調能夠促進細胞存活，而mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素能夠顯著上調細胞的凋亡率，這主要是因為雷帕霉素抑制mTORC1/HIF-1α信號通路，促使人骨肉瘤MG63細胞促凋亡蛋白Bax表達增多，同時抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少。因此，雷帕霉素對體外培養的人骨肉瘤MG63細胞的促凋亡作用依賴mTORC1/HIF-1α信號通路。

3.1 雷帕霉素促進人骨肉瘤細胞凋亡與mTORC1活性降低有關mTOR復合物有2種不同的存在形式：mTORC1和mTORC2，它們分別接受相應的上游信號，參與調節不同的生物學過程。mTORC1活性參與實體腫瘤的增殖和侵襲，mTORC1活性抑制劑促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤侵襲[10-11]。但是在實體腫瘤內，mTORC1活性呈現不均一性，使得mTORC1活性抑制劑的抗腫瘤作用減弱[11]。人骨肉瘤組織mTORC1過度活化是導致骨肉瘤細胞耐藥的一個很重要原因，mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素能夠增加骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性，抑制細胞增殖和促進細胞凋亡[12]。由于骨肉瘤組織內部常處于缺氧狀態[6]，本研究通過體外培養人骨肉瘤MG63細胞并模擬缺氧環境，用0.1 nmol/L雷帕霉素刺激人骨肉瘤MG63細胞發現，細胞凋亡率明顯增加。這說明雷帕霉素抑制人骨肉瘤MG63細胞存活。另外，本研究證實缺氧會誘導人骨肉瘤MG63細胞mTORC1活性(p-S6蛋白表達)增加，但是與常氧組細胞相比，缺氧組細胞凋亡率未發生顯著改變，這說明缺氧不會影響人骨肉瘤MG63細胞在體外環境中的存活；接下來又在缺氧條件下給予人骨肉瘤MG63細胞雷帕霉素處理，發現人骨肉瘤MG63細胞mTORC1活性明顯抑制。這與以往的文獻報道結果[3-4]一致。說明雷帕霉素可能通過抑制缺氧條件下的人骨肉瘤MG63細胞的mTORC1活性而促進骨肉瘤細胞凋亡。

3.2 雷帕霉素促進人骨肉瘤細胞凋亡依賴mTORC1/HIF-1α信號通路缺氧微環境為實體腫瘤的惡性增殖和侵襲提供了很好的保障，缺氧誘導腫瘤組織過表達HIF-1α，促進其合成分泌血管內皮生長因子，進而激活血管化，增加腫瘤細胞對化療藥物的抵抗[5]。本研究發現缺氧環境下人骨肉瘤MG63細胞高表達HIF-1α，并向核內轉移，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，同時抑制促凋亡蛋白Bax表達，提示高表達HIF-1α可能有利于人骨肉瘤MG63細胞在缺氧環境下存活。有文獻報道腎癌細胞中活化的mTORC1促進HIF-1α過表達，進而抑制p-53蛋白調控的細胞凋亡過程[13]。二甲雙胍通過抑制mTORC1/HIF-1α信號調控CD19+白血病進展[14]。我們猜測雷帕霉素在缺氧條件下誘導人骨肉瘤MG63細胞凋亡可能與mTORC1/HIF-1α信號活性改變有關。

本研究結果表明，雷帕霉素顯著下調缺氧條件下人骨肉瘤MG63細胞的HIF-1α蛋白表達，這與抑制mTORC1活性的結果并行，提示mTORC1和HIF-1α是調控人骨肉瘤MG63細胞存活的重要分子。進一步研究發現，當上調人骨肉瘤MG63細胞mTORC1活性時，HIF-1α表達上調，發揮抑制細胞凋亡作用；當下調人骨肉瘤MG63細胞HIF-1α表達時，細胞mTORC1活性不受影響，但促進細胞凋亡活性；當同時下調人骨肉瘤MG63細胞HIF-1α表達和激活mTORC1信號時，細胞依然保持較高水平的凋亡活性。這些結果表明，mTORC1調控人骨肉瘤MG63細胞凋亡是通過HIF-1α信號實現的。HIF-1α可增加細胞對缺氧環境的適應性，實體腫瘤內部不可避免的存在缺氧環境，正是因為腫瘤細胞高表達HIF-1α，進而發揮其核內轉錄調控作用，最終促進腫瘤細胞增殖和遷移。而mTOR能夠調控缺氧條件下HIF-1α以及其下游靶基因的表達，敲除mTOR或者mTOR抑制劑能夠抑制HIF-1α表達，顯著減緩腫瘤細胞增殖[15]。我們在體外模型中證實人骨肉瘤MG63細胞存活依賴mTORC1/HIF-1α信號激活，雷帕霉素通過抑制mTORC1/HIF-1α信號從而促進人骨肉瘤MG63細胞凋亡，說明mTORC1/HIF-1α可能是骨肉瘤治療的新靶點。

綜上所述，缺氧條件下雷帕霉素能夠促進人骨肉瘤MG63細胞凋亡，模擬實體腫瘤組織內部缺氧環境，證實雷帕霉素可能通過調控mTORC1/HIF-1α信號促進人骨肉瘤MG63細胞凋亡。雖然本研究無體內實驗數據進一步證實，但是這一結論為進一步研究人骨肉瘤細胞的耐藥機制提供了新的理論依據，也為臨床治療骨肉瘤提供新的作用靶點。