痛風患者NLRP3基因多態性觀察

李瑞，苗蕾，陳鄔錦，冀琨，張蓓，孫玉萍

1 新疆醫科大學基礎醫學院，新疆烏魯木齊830011；2 新疆醫科大學公共衛生學院；3新疆醫科大學第六附屬醫院

痛風(Gout)是由于尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體沉積于關節及周圍軟組織引起的以局部紅、腫、熱、痛為主要臨床表現的自限性炎癥性關節炎[1]。痛風急性發作時患者受累關節呈刀割樣疼痛，導致關節功能受限，嚴重影響患者的生活質量。近年來高嘌呤膳食模式及生活習慣的不斷改變，導致痛風的發病率呈逐年增高趨勢[2]。目前全球痛風發病率0.1%～10%，而我國痛風發病率約為2%[3]。目前，關于痛風發病機制的相關研究不斷增多，但確切發病機制尚不完全清楚。痛風的急性發作受遺傳因素和環境因素的共同影響，而遺傳因素在痛風的急性發作過程中占主要作用。研究[4-5]發現，三磷酸腺苷結合家族G2(ABCG2)、蛋白激酶D2 (PKD2)、葡萄糖易化轉運蛋白9(SLC2A9)、鉀電壓門控通道Q亞家族成員1(KCNQ1)、溶質載體家族22成員12(SLC22A12)、磷酸鈉運輸蛋白1(SLC17A1)和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)等基因的多態性與痛風的易感性間存在相關性。作為內源性危險信號分子的MSU晶體能有效激活Toll樣受體信號通路和NOD樣受體信號通路，產生并釋放促炎細胞因子白細胞介素1(IL-1)、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，通過級聯放大效應啟動炎癥應答，引起痛風的急性發作[6]。2013年1月～2019年6月,我們聚焦尿酸鹽晶體激活NOD樣受體信號通路引起痛風急性發作這一致病機制，選取NLRP3基因作為目標基因，通過分子生物學方法檢測痛風患者目標基因多態性，旨在探索NLRP3基因多態性與痛風易感性的關系，為探索痛風遺傳因素及痛風的診斷及治療方法提供實驗室數據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院同期收治的痛風患者267例及健康者448例，均為男性漢族。痛風的診斷符合2015年美國風濕病學會制定的痛風診斷標準[7]。納入者年齡20～70歲，且相互間沒有血緣關系。排除標準：排除患有惡性腫瘤、血液系統疾病、肝腎疾病、自身免疫性疾病者，排除近期服用促進或降低尿酸排泄藥物者。本研究獲得新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審批，納入者知情同意。兩組年齡具有可比性，體質量指數(BMI)、收縮壓(DBP)、血尿酸(SUA)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平在兩組間具有統計學差異(P均<0.05)，且除了HDL-C外，其他指標均表現為痛風患者高于健康者。

1.2 痛風患者及健康者血清NLRP3基因檢測及分型 收集痛風患者及健康者禁食12 h晨起空腹靜脈血液5 mL,3 500 r/min分離血清，-80 ℃保存備用。依據在國際人類基因組單體型圖計劃(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)中顯示的SNP信息，選取NLRP3基因rs7525979、rs3806268 和rs10754558三個多態性位點為目標位點。選用基因組DNA提取試劑盒，按操作說明提取外周靜脈血液標本中的基因組DNA，用經過Primer 3軟件設計的引物進行PCR(polymerase chain reaction)反應，最后用探針法對目標位點進行基因分型。NLRP3基因單核苷酸多態性位點的連接產物序列如下：rs7525979上游引物為5′-CACTTCCAGTTTTTGCCGGG-3′,下游引物為5′-GGGAATGGCTGGTGCTCAAT-3′；rs3806268上游引物為5′-GCTGTTTGACCCCGATGATGAG-3′,下游引物為5′-CCCCAGGCTCCTCTGTGTCA-3′；rs10754558上游引物為5′-CTTTACGCCAGGGTGAGGAAGAC-3′,下游引物為5′-AGCGGGAATGATGATATGAGCA-3′。

1.3 資料收集方法 選用統一的問卷收集研究對象的一般健康資料，包括姓名、性別、年齡、民族、現病史、既往史、家族遺傳史、服藥史、身高、體質量、收縮壓、舒張壓等。選用新疆醫科大學第一附屬醫院檢驗科日立7060全自動生化分析儀測定納入者SUA、TG、TC、BUN、GLU、CREA、HDL-C和LDL-C等一般生化指標。

2 結果

2.1 痛風患者及健康者NLRP3基因rs7525979、rs3806268及rs10754558位點基因型和等位基因頻率比較 痛風患者NLRP3基因rs7525979位點基因型CC、CT、TT分別為177、81、9例，等位基因C、T頻率分別為81.5%(435/534)、18.5%(99/534)；健康者分別為289、146、13例，等位基因頻率分別為80.8%(724/896)、19.2%(172/896)。痛風患者NLRP3基因rs3806268位點基因型GG、GA、AA分別為59、118、90例，等位基因G、A頻率分別為44.2%(236/534)、55.8%(298/534)；健康者分別為104、238、106例，等位基因頻率分別為49.8%(446/896)、50.2%(450/896)。痛風患者NLRP3基因rs10754558位點基因型GG、GC、CC分別為48、135、84例，等位基因G、C頻率分別為43.3%(231/534)、56.7%(303/534)；健康者分別為95、234、119例，等位基因頻率分別為47.3%(424/896)、52.7%(472/896)。痛風患者及健康者NLRP3基因rs3806268位點基因型和等位基因分布具有統計學意義差異(P均<0.05)。

2.2 NLRP3基因rs7525979、rs3806268及rs10754558位點基因型與痛風易感性的相關性 加性模型分析結果表明，與GG基因型比較，NLRP3基因rs3806268位點AA基因型為痛風的保護因素(OR為0.58,95%CI:0.41～0.84)；隱性模型分析結果表明，與GG+GA基因型比較，AA基因型為痛風的的保護因素(OR為0.61,95%CI:0.44～0.85)。rs7525979和rs10754558位點在不同遺傳模型中未見與痛風存在相關性(95%CI橫跨1)。

3 討論

痛風是目前我國的第二大代謝性疾病，其急性發作與多因素密切相關。研究表明，男性痛風的發生率高于女性，但女性隨著年齡的升高，體內激素水平的不斷變化，使得女性痛風的發生率也逐漸增高[8]。高嘌呤飲食如攝入過多海產品、動物內臟等或飲酒均能增加痛風的發病率[9]。痛風具有家族遺傳性的特點且其發生與肥胖、高血壓、糖尿病、腎臟疾病、心腦血管疾病等密切相關[10-13]。本研究結果顯示，BMI、DBP、SUA、GLU、BUN、CREA、TG、HDL-C 和LDL-C水平在痛風組和健康對照組間差異具有統計學意義。

MSU晶體通過被模式識別受體(Pattern-recognition receptors，PRR)識別可啟動機體先天性免疫應答和炎癥反應，而位于細胞膜上的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和位于細胞質中的NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)是機體內兩大類重要的PRR。研究表明，NLR可與凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱天冬氨酸酶(caspase-1)一起形成炎性體，參與調控多種疾病，如痛風、糖尿病、腎臟疾病、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、腸炎、口腔疾病等[14-15]。NLRP3(NLR family，pyrin domain containing 3)屬于NOD樣家族成員，可通過其富含亮氨酸重復序列的羧基端(leucine rich repeat，LRR)識別MSU晶體并與之結合，通過自身寡聚化，活化相關受體。此時位于NLRP3氨基端的熱蛋白結構域(PYD)即可與ASC羧基端的PYD結構域結合，招募ASC。再通過ASC氨基端的CARD結構域與caspase-1前體的CARD結構域結合，活化caspase-1。活化的caspase-1能加工并分泌成熟的IL-1β、IL-18等促炎細胞因子，而成熟的IL-1β能夠通過活化T細胞從而激活NF-KB或MAPK信號通路，啟動先天性免疫應答和炎癥反應，引起痛風的急性發作[16]。

NLRP3基因多態性與疾病易感性間關系的研究已經開展。LEE等[17]的薈萃分析結果表明NLRP3基因rs10754558位點基因突變與自身免疫和炎癥性疾病間無相關性，但WU等[18]的研究結果則發現rs3806268位點多態性與女性非結核性肺部疾病間存在相關性；張鯤等[19-20]的研究發現,rs10754558位點突變與下肢動脈硬化閉塞癥遺傳易感性間存在相關性，且GG基因型為該疾病的危險因素。本研究結果發現，NLRP3基因rs3806268位點基因型和等位基因在痛風組和對照組間分布具有有統計學意義的差異,且該位點AA基因型為痛風的保護性因素，能降低痛風的發病風險。NLRP3炎性信號通路可能參與了痛風炎癥的發病，NLRP3能夠通過活化IL-1β炎性因子，調控機體炎性反應，隨著分子生物學技術的不斷發展，NLRP3基因多態性與痛風易感性研究深入開展將為痛風治療藥物的研制及防止痛風發作提供新靶點。

綜上所述，NLRP3基因rs3806268位點基因多態性與痛風易感性間存在相關性，rs3806268位點突變可能是痛風的保護性因素。但本研究依然存在一些局限性，如本研究為病例對照研究，樣本含量還不十分充足且研究對象來源于同一地方的同一醫院，可能存在選擇偏倚，結果不能得以廣泛推廣。因此為更好的探索痛風發病的遺傳因素，今后大樣本、前瞻性研究的開展是必不可少的。