人絲裂原活化蛋白激酶相關蛋白1在肝細胞癌中轉錄調控的生物信息學分析

張玲玲，曹輝，白班俊，鐘竹，楊菁，許鐘

貴州大學醫學院 貴州省人民醫院，貴陽550002

原發性肝癌是最常見惡性腫瘤之一，由于肝細胞癌(HCC)占其中90%以上，因此肝癌也常用來表示HCC。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶[1]，在細胞分裂分化、凋亡、自噬、遷移、蛋白質翻譯和修飾以及細胞骨架重建等生物學過程中發揮作用，具有調控腫瘤細胞增殖和凋亡的功能。mTOR以mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)的催化亞基形式存在，而mTORC2及其異常調節信號通路與多種腫瘤的發生有關。Xu等[2，3]研究表明，mTORC2在肝癌發生中具有關鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶相關蛋白1(MAPKAP1)又稱mSin1，是多蛋白復合物mTORC2的主要蛋白之一[4]。因此，針對MAPKAP1轉錄調控的研究，將有助于充分認識肝癌的發生機制。2019年3～8月，我們應用生物信息學方法對MAPKAP1基因啟動子區進行序列分析，預測該基因近端啟動子區的轉錄因子結合位點，進一步分析其在肝癌中上調有關的轉錄因子，為研究其轉錄調控機制、探索肝癌治療新思路提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 人MAPKAP1基因啟動子區序列的獲得 在美國國家生物技術信息中心在線核苷酸數據庫(Gene Bank)中獲得MAPKAP1基因序列，并基于MAPKAP1的基因序列ID，下載NCBI網站上外鏈接GeneCopoeia Inc.所提供的啟動子序列。

1.2 人MAPKAP1基因啟動子區轉錄因子結合位點的預測分析 在轉錄因子數據庫TRANSFAC中，通過在線轉錄因子預測軟件Patch、P-Match、AliBaba2(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html)預測MAPKAP1啟動子序列順式作用元件，分析其可能轉錄因子結合位點。應用Patch在線軟件分析，參數設置set of sites選擇“vertebrates”，Lower score boundary設為“90”，其他采用默認設置；應用P-Match在線軟件分析，限定“liver_specific”，Cut-offs使用參數分別為“to minimize the sum of both error rates”“to minimize false negative matches”；應用AliBaba2在線軟件分析，取在線軟件默認設置參數。

1.3 肝癌組織中人MAPKAP1基因啟動子區可能轉錄因子的篩選 應用在線肝臟基因數據庫Liveratlas(http://liveratlas.hupo.org.cn/)[5]檢索，選擇“Disease”，以 “hepatocellular carcinoma”為檢索詞檢索，依次點擊“HuLDi00052”和“more...”，篩查肝癌組織中表達上調的基因；與預測的轉錄因子進行對比，獲得目標轉錄因子數據集。

1.4 肝癌組織中人MAPKAP1與啟動子區轉錄因子相關性分析 通過TCGA數據庫(https://cancergenome.nih.gov/)提取篩選出的轉錄因子與MAPKAP1的肝癌組織芯片表達結果，采用GraphPad Prism 5統計軟件行Pearson相關性分析，P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人MAPKAP1基因基本信息及啟動子序列 人MAPKAP1基因ID為79109，定位于9號染色體負鏈(9q33.3)；其mRNA ID包括NM_001006617.2、NM_001006618.1、NM_001006619.1、NM_001006620.1、NM_001006621.1、NM_024117.3，在肝臟及肝癌中主要為NM_001006621.1、其次為NM_001006619.1、NM_001006620.1等。該基因啟動子克隆產品ID為HPRM31628，全長1 689 bp，位于轉錄起始位點-1 470 bp至+218 bp。

2.2 人MAPKAP1基因啟動子區轉錄因子結合位點預測分析結果 Patch在線軟件分析，共預測1 181個轉錄因子結合位點，手工篩查物種為人的轉錄因子結合位點共598個，匯總去重后共涵蓋149個轉錄因子。P-Match在線軟件分析，當Cut-offs使用參數為“to minimize the sum of both error rates”時，預測到31個轉錄因子結合位點，匯總去重后共涵蓋15個轉錄因子；當使用參數為“to minimize false negative matches”，共預測到362個轉錄因子結合位點，匯總去重后共涵蓋28個轉錄因子。AliBaba2在線軟件分析，共預測155個轉錄因子結合位點，匯總去重后共涵蓋了63個轉錄因子。以上軟件預測結果匯總共255個，去重后共涵蓋214個轉錄因子。

2.3 肝癌組織中人MAPKAP1基因啟動子區可能轉錄因子篩選結果 應用在線基因數據庫Liveratlas提取肝癌組織中表達上調的基因共2 171個，與上述預測的214個轉錄因子進行對比，取交集獲得目標轉錄因子共有13個：C/EBP、CNBP、CTCF、DBP、IRF2、LEF1、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1。

2.4 肝癌組織中人MAPKAP1與啟動子區轉錄因子表達的相關性 相關性分析顯示，轉錄因子C/EBP、DBP、LEF1與MAPKAP1表達呈正相關(r分別為0.151 3、0.235 6、0.155 3，P均﹤0.01)，CNBP、CTCF、IRF2、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1與MAPKAP1表達無明顯相關(r分別為-0.036 9、0.000 2、-0.004 0、-0.079 2、-0.132 6、0.042 4、0.033 9、-0.064 3、0.072 3、0.028 5，P均﹥0.05)。

3 討論

原發性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，流行病學資料顯示中國肝癌病例占全球50%以上[6，7]，其發生過程中涉及一系列信號通路的異常活化[8]。由于肝癌異質性大，當前的治療手段適應范圍和療效有限；對其發病分子機制進行深入探索、尋找新的治療突破靶點，仍是肝癌研究的一個重要方向。PI3K/AKT/mTOR信號通路由PI3K、AKT和mTOR 3個重要分子節點組成，在細胞的正常生理代謝、腫瘤細胞的發生發展中發揮重要而關鍵的作用[9～12]。其中，AKT/mTOR通路的活化是肝癌發生最常見的分子事件之一。因此，mTOR抑制劑可以通過特異性抑制mTOR復合物及其信號通路中的各種信號分子而發揮抗腫瘤作用。研究mTORC2的結構、功能、參與的信號通路及機制，可能為探索腫瘤的發生機制及其相關特異性靶向抑制劑治療腫瘤的研究提供新方向。

mTORC1和mTORC2是mTOR的兩種多蛋白復合體。mTORC1主要結構由mTOR催化亞單位、mLST8、調節相關蛋白raptor、負向調節因子DEPTOR和 PRAS40組成，主要功能為調控蛋白質合成、調控細胞生長與增殖，能被雷帕霉素抑制[13，14]。mTORC2在肌動蛋白細胞骨架組織和細胞存活等方面發揮重要作用，由結構蛋白mTOR、mLST8、MAPKAP1、Rictor、Deptor、Protor、Hsp70構成，這些不同的結構蛋白參與不同的生命活動調節過程[15，16]。mTORC2與細胞信號傳導關系密切。多種細胞內或細胞外的因素，如生長因子、營養素、能量、應激等，會通過mTORC2調節細胞的生長。Rictor及MAPKAP1是mTORC2構成一個整體的必要條件。MAPKAP1作為mTORC2的主要蛋白之一，具有保持mTORC2結構穩定的功能，可剪切成5個亞基，含有Ras結合區和血小板-白細胞C激酶底物同源結構域，能夠抑制Ras信號。MAPKAP1參與mTORC2將AKT Ser473磷酸化過程，其亞型可獨立組裝mTORC2[17～20]，也是mTORC2亞細胞定位到質膜的必要條件。mTORC2通過mSin1亞基在細胞膜上的定位，使mTORC2靠近其底物AKT、SGK和PKC。因此，細胞膜定位是mTORC2-AKT調控的一個重要方面。MAPKAP1是mTORC2激酶活性的關鍵負調節因子。盡管生長因子刺激和核糖體結合都是已知的mTORC2激活因子，mTORC2的上游調控仍然不是很清楚[21]。

本研究通過利用生物信息學技術分析發現，在預測的轉錄因子中共有13個在肝癌中表達上調，其中C/EBP、DBP、LEF1與MAPKAP1的表達呈正相關。C/EBP α是CCAAT增強子結合蛋白家族的一員，作為轉錄因子參與細胞分化、增殖、代謝以及免疫應答、炎癥反應、腫瘤發生等病理生理過程，在多種腫瘤中異常表達。Lu等[22]研究表明，C/EBP α在肝癌組織中表達上調則患者臨床預后更差。有報道顯示，mTORC2/AKT可通過下游分子上調C/EBP α的表達[23]，但C/EBP α是否影響mTORC2復合蛋白，尤其是MAPKAP1尚有待進一步研究。DBP屬于脯氨酸和酸性氨基酸豐富的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，在肝臟解毒和藥物代謝中起重要作用。持續的DBP上調，可通過激活ERK1/2和 MAPK等信號通路促進癲癇等疾病的發生[24]。但是，DBP是否可通過轉錄調節MAPKAP1表達未見報道。LEF1是LEF/TCF家族的成員之一，作為Wnt信號通路中的調控分子，可與β-連環蛋白結合來激活下游基因的轉錄，導致腫瘤的發生發展。Fang等[25]研究發現，LEF1還可通過NOTCH信號通路增加肝癌的侵襲能力和耐藥性，與臨床患者預后不良相關。目前，尚無關于LEF-1和mTORC2信號通路(包括MAPKAP1)之間相互作用的報道。綜上預測及分析，在肝癌發生過程中，轉錄因子C/EBP、DBP、LEF1可能在轉錄水平上促進MAPKAP1的表達。此結果可通過小鼠肝癌模型等體內實驗進一步驗證，其進一步研究為充分闡釋mTORC2生物學功能提供生物信息學基礎；鑒于目前研究中提示的mTORC2與腫瘤的關系，這可能為探索肝癌的發生機制及研究其特異性靶向治療藥物提供新的思路。