軟骨細胞凋亡引發骨關節炎的機制研究進展

王新軍，袁銀鵬，王越，田晨陽，王宇澤

山西醫科大學第二醫院，太原030000

骨關節炎(OA)是全世界范圍內最常見的骨關節疾病，據估計發達國家每年在治療OA方面的費用高達國內生產總值的1%～1.5%[1]。該病主要包括軟骨細胞凋亡和細胞外基質(ECM)的退行性變化兩方面因素，導致關節軟骨結構和功能喪失，同時伴隨有軟骨修復和骨贅形成。生理狀態下，軟骨細胞增殖和凋亡處于動態平衡，以維持細胞數量及功能的穩定。然而，一旦軟骨細胞發生過度凋亡就會打破這一動態平衡。研究表明，軟骨細胞凋亡在OA病理進程中起重要作用。現從軟骨細胞凋亡的媒介、誘導劑及信號轉導通路三個方面對軟骨細胞凋亡誘導OA的可能機制作一綜述。

1 軟骨細胞凋亡的媒介

1.1 Caspase 在生理條件下，Caspase以無活性的酶原形式存在于細胞質中，并通過不可逆的蛋白水解作用而激活。例如：凋亡效應子Caspase-3和Caspase-7，它們通常以無活性的二聚體形式存在，其活性受大小亞基之間的連接子調控。連接子一旦被蛋白水解，使Caspase-3和Caspase-7的催化位點得以組裝，從而影響凋亡的下游調控事件。由于軟骨細胞三維計數減少與Caspase-3活化相關，因此Caspase-3陽性細胞數量被作為細胞凋亡的指標。Gao等[2]研究發現，在OA大鼠軟骨細胞中Caspase-3表達增高，表明軟骨細胞凋亡在OA中起重要作用。Musumeci等[3]分離OA患者膝關節軟骨中的軟骨細胞，發現DR5受體、TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)和Caspase-3表達增強，提示在凋亡的軟骨細胞中存在外源性凋亡途徑的激活。學者們通過固定新西蘭大白兔的后肢導致發育性髖關節脫位，從而誘發繼發性OA。結果發現，在疾病的早期階段，髖關節軟骨中軟骨細胞過度凋亡、Caspase-3過表達，且兩者之間呈正相關[4]。

1.2 Bcl-2蛋白家族 細胞質中的Bcl-2蛋白家族對細胞凋亡起著中心調控的作用，其家族成員通過調節線粒體膜通透性來控制線粒體凋亡信號[5]。細胞凋亡主要取決于Bcl-2蛋白家族成員之間的相互作用，促凋亡和促存活蛋白整合了上游眾多的生存和破壞信號后，確定是否發出細胞凋亡指令。實驗表明，Bcl-2的表達水平會影響OA的發生和發展。Huang等[6]采用橫斷前交叉韌帶的術式建立大鼠OA模型，通過免疫印跡技術發現Bcl-2表達水平降低。Miao等[7]實驗表明，OA關節軟骨和IL-1β處理的軟骨ATDC5細胞中Bax表達均上調。

2 軟骨細胞凋亡相關的誘導劑

在受損的軟骨組織中，軟骨細胞產生一氧化氮(NO)，這是一種介導軟骨細胞雙重作用的多功能分子。Marcello等[8]發現，NO對培養的軟骨細胞無細胞毒性，反而可以保護軟骨細胞免受氧化應激損傷。但是，NO異常升高可能是OA病理生理的一個重要因素，因為它可以減少軟骨細胞中白介素1受體拮抗劑(IL-1RA)的合成，而軟骨細胞產生的IL-1RA可阻止軟骨的損傷與破壞。研究表明，創傷性關節炎大鼠軟骨細胞中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和NO的表達顯著升高。iNOS和NO異常升高可導致軟骨細胞凋亡和ECM代謝失衡，抑制軟骨細胞增殖，并在創傷性關節炎的病理進程中發揮相應的作用[9]。

OA病理過程中，IL-1β和TNF-α是兩個重要的炎癥因子。軟骨細胞受到IL -1β刺激后，生成對細胞有害的氧自由基，與NO反應的產物可誘導細胞凋亡。IL-1β誘導NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中關鍵酶的激活，包括p50、p52、Rel、Rel A、Rel B、p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外信號調節激酶(ERK)[10]，而上述兩種信號通路參與了軟骨細胞的增殖、分化和凋亡。Larsson等[11]研究發現，隨著膝關節滑液中TNF-α水平升高，OA患者關節間隙的丟失及日常活動能力的降低將進一步惡化。盡管TNF是否介導軟骨細胞凋亡仍有爭議，但實驗證明TRAIL可通過激活Caspase-8和Caspase-3介導細胞凋亡，并且細胞毒性呈劑量依賴性。

在外源性凋亡途徑中，死亡受體Fas與其配體FasL相結合，從而生成死亡誘導信號轉導復合物；后者通過Fas相關蛋白和死亡結構域銜接分子募集并激活Caspase-8，Caspase-8的活性片段在胞質中釋放，通過裂解和產生有活性的Caspase-3片段傳遞凋亡信號。Hashimoto等[12]用Fas抗體處理軟骨細胞，經電子顯微鏡分析細胞凋亡的典型胞核和細胞質變化，發現部分軟骨細胞表達Fas且對Fas誘導的細胞凋亡敏感。

3 軟骨細胞凋亡的相關信號轉導通路

3.1 MAPKs通路 MAPKs是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，經細胞外刺激活化，如細胞因子、神經遞質、細胞應激和黏附等。MAPKs途徑通過三層激酶級聯轉導細胞外刺激因子進入核內并激活相應基因表達，從而促進細胞增殖、分化和凋亡。該途徑由ERK1/2、p38和JNK 3個信號級聯通路組成，在多條信號轉導通路中充當中心節點。Sun等[13]研究表明，通過抑制p38-MAPK通路可以抑制人OA軟骨細胞凋亡，降低炎癥因子表達。Ge等[14]研究發現，OA患者的ERK1水平升高與細胞凋亡和軟骨退變有關，ERK1可能通過p38-MAPK信號通路促進OA患者的軟骨細胞凋亡。p38-MAPK信號通路對于細胞外刺激向細胞核的傳遞和調節轉錄因子活性至關重要，并且在介導OA軟骨損傷中起關鍵作用。促炎細胞因子等刺激因子活化MAPKi激酶激酶(MKKK)，反過來觸發MAPK激酶(MKK)表達和蛋白磷酸化，最終增加p38-MAPK或JNK-MAPK相關基因的表達。在OA軟骨細胞中，JNK磷酸化以激活AP-1；后者調節炎癥因子表達，如TNF-α、IL-1β，使得蛋白多糖合成抑制、軟骨降解酶MMP-13合成增加[15]。同樣，p38通路能夠激活活化轉錄因子2和Caspase-3，進而轉導與凋亡相關的信號[16]。研究發現，抑制ERK、p38和JNK途徑降低了MKK基因的表達，下調了ERK、p38和JNK總蛋白濃度和磷酸化，進而抑制了細胞凋亡[13]。

3.2 PI3K/AKT通路 PI3K/AKT通路有多種生物作用，包括營養物質吸收、合成代謝、細胞生長、遷移和生存等諸多方面。PI3K活化并激活AKT，將其定位于質膜中。AKT可以產生許多下游效應，如激活環磷腺苷效應元件結合蛋白，抑制p27和激活mTOR[17]。研究發現，抑制PI3K/AKT/mTOR途徑可促進關節軟骨細胞的自噬，并且減弱OA大鼠的炎癥反應[18]。AKT能介導中性粒細胞中CXCR2信號的轉導，CXCR2可以活化細胞內鈣離子并導致PI3K/AKT通路激活。Sherwood等[19]認為，破壞CXCR1/2信號轉導是OA中的重要事件，導致軟骨細胞表型穩定性喪失并促進OA樣改變。

3.3 Wnt/β-catenin通路 許多研究集中在關節組織中Wnt信號轉導的參與，雖然為Wnt信號在軟骨穩態和OA中的功能提供了充分的證據，但支撐這些作用的機制仍有待進一步探究。Wnt通路中的蛋白分子能保持一定的平衡以實現細胞穩態和關節完整性。與其他生長因子相比，Wnt信號轉導能夠在誘導細胞增殖的同時賦予生長組織成形的能力，并發揮定向生長因子的作用。Wnt/β-catenin通路的主要組成為異源三聚體復合物，包括配體Wnt、單次跨膜共受體LRP和7-跨膜信號轉導受體Frizzled。該通路可通過控制軟骨細胞、成骨細胞和滑膜細胞的功能在關節組織中發揮獨特作用[20]，Wnt通路通過調節β-catenin的細胞內水平和亞細胞定位來觸發其在軟骨細胞內的信號轉導。Wnt信號通路在正常軟骨細胞中被抑制，一旦被激活將導致OA軟骨損傷[21]。特定條件下，成年小鼠關節軟骨細胞中Wnt5a可以激活β-catenin，進而導致軟骨細胞過早分化和OA樣表型，包括軟骨基質的逐漸丟失和骨贅的形成[22]。

3.4 Fas/FasL通路 Fas(CD95)是腫瘤壞死因子受體家族的成員，是一種含有死亡結構域的受體，可激活細胞凋亡信號。死亡受體Fas是軟骨細胞凋亡的重要生物標志物之一，與其配體FasL結合后可導致細胞凋亡[23]。Fas信號轉導可以通過激活Caspase-8來觸發細胞凋亡，Caspase-8可激活下游效應子Caspase-3。雖然Fas在軟骨細胞凋亡中的作用飽受爭議，但仍有許多證據來支持這種關聯。例如，與正常軟骨組織相比，OA軟骨組織中Fas表達升高。在人類軟骨組織中，OA病灶附近的Fas表達高于病灶遠端區域。據報道，老年人軟骨組織中Fas水平較高，在OA患者滑液中也發現了大量的可溶性FasL。Ryu等[24]研究發現，缺氧誘導因子2α可通過上調Fas表達放大Fas誘導的軟骨細胞凋亡信號。

3.5 NF-κB通路 NF-κB通路被認為是OA軟骨病理生理學中眾多炎癥機制的常見最終通路，在維持軟骨細胞穩態中具有廣泛的功能。NF-κB是一種核轉錄因子，可進入細胞核以調節基因表達，并具有多種細胞調控功能，如炎癥、促存活和應激誘導等。Liu等[25]發現，隨著OA病理進程的不斷惡化，TLR-2、NF-κB和MMP-13及相關炎癥因子的表達也不斷上調。NF-κB通路通過誘導HIF-2α引起軟骨細胞中MMP-13表達上調，而MMP-13表達上調在OA的發病機制中起重要作用。總之，NF-κB信號轉導通路影響軟骨基質重塑、軟骨細胞凋亡、滑膜炎癥，并且對末端軟骨細胞分化的下游調節劑具有間接刺激作用[26]。

3.6 JAK/STAT通路 JAK/STAT信號轉導通路通過細胞中各種蛋白質之間的相互作用，將細胞外的化學信號傳遞到細胞核，激活相應的基因，參與細胞免疫、分裂、死亡及腫瘤形成等發生。該信號轉導通路包括Janus激酶(JAK)、信號轉導和轉錄蛋白激活因子(STAT)以及細胞表面受體(結合化學信號)共3個關鍵蛋白。細胞信號抑制因子(SOCS)是JAK/STAT通路的一類內源性負調控因子，由SOCS1～7和CIS至少8種成分組成。降低SOCS2和CIS1基因表達并激活JAK/STAT信號通路，可能導致OA進展、軟骨ECM代謝失衡[27]。Wiegertjes等[28]使用編碼SOCS3的腺病毒轉染G6人軟骨細胞系和原代軟骨細胞，發現SOCS3過表達可完全抑制TGF-β對STAT3的磷酸化，表明SOCS3可能是軟骨細胞重要的調節因子，對OA相關的軟骨損傷有重要意義。STAT3是一種有效的轉錄因子，調節多種涉及OA發病機制的靶基因表達，包括蛋白酶(如MMP-3、MMP-13)、細胞因子和趨化因子(如IL-6、MCP-1)，以及重要的軟骨細胞增殖、分化和凋亡的調節因子(如Sox9、細胞周期蛋白D1、Bcl-3)。

3.7 高流體剪切力通路 Zhu等[29]使用cDNA微陣列結合聚類算法，提出了一種新的信號通路；通過該通路，高流體剪切可介導COX-2/L-PGDS依賴性軟骨細胞凋亡。他們通過實驗發現，L-PGDS控制蛋白激酶A(PKA)的下調，而PKA又調節Polo樣激酶1(Plk1)和Plk3。Plks控制參與軟骨細胞凋亡的p53效應子(TP53INPs、Fas和Bax)的轉錄。

綜上所述，OA發病機制遠比想象的要更為復雜，這也為該病的藥物治療提出了嚴峻的挑戰。這也可能是目前臨床對OA的治療集中在緩解癥狀，而不是預防或治愈的原因之一。針對某一條信號轉導通路上的關鍵靶點藥物，在阻斷軟骨細胞凋亡的同時，還可能具有潛在的毒性作用。因此，針對軟骨細胞凋亡信號轉導通路的生物靶向治療,未來可能還有很長的路要走。令人振奮的是，人們越來越關注研究不同OA表型背景中細胞凋亡的分子機制，這將為OA和軟骨細胞凋亡之間的相關性提供更多證據，以期進一步研究各種通路間的復雜關系以及各種蛋白分子、媒介、基因之間的相互作用。通過對OA病理機制不斷地深入探究，將為這一慢性疾病的診斷、治療、轉歸等提供更先進的理論依據和研究手段。