分離自慢性肝病患者的62株泛耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因檢測及菌株鑒定分型

楊耿俠，陳銘，栗光明

首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京100069

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii, AB)是一種細菌性病原體，在免疫功能低下患者中可導致嚴重感染。目前，AB已成為世界范圍內重要的機會性院內感染病原體，特別是對于重癥監護病房(ICU)的患者[1]。AB菌株極易對抗生素發生耐藥。研究[2]發現，韓國的一所大學附屬醫院的AB菌株對美羅培南的耐藥率高達32.5%。而且，多數碳青霉烯酶類耐藥的AB多藥耐藥甚至泛耐藥菌株。泛耐藥(extensively drug-resistant)是指除多粘菌素、替加環素外，對臨床所有一線抗生素均耐藥[3]。AB對碳青霉烯類抗生素耐藥發生機制中最常見的原因是OXA型碳青霉烯酶基因突變[4]。OXA型碳青霉烯酶基因突變主要有四種類型，分別為OXA-23、OXA-40、OXA-58、OXA-51。多數AB菌株中存在OXA-51碳青霉烯酶基因，因此OXA-51被認為是AB的固有基因。OXA-51型碳青霉烯酶能水解青霉素、碳青霉素類抗生素，但分解作用非常弱。目前臨床發現，AB對耐碳青霉烯類抗生素耐藥最常見的機制是OXA-23基因及其亞型突變，其耐藥的發生可能與超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs，由PER-1基因、PER-2基因和VEB-1基因突變導致)、產金屬β-內酰胺酶(MBLs，由VIM基因、IMP基因突變導致)、GES酶和氨基糖苷類修飾酶、外排泵、滲透性缺陷及耐藥靶點改變有關[5, 6]。研究[7，8]發現，78.3%的碳青霉烯耐藥AB菌株存在與OXA-23基因突變有關，其中ST22是最常見的多位點序列分型類型。多位點序列分型(MLST)是一種基于管家基因核酸序列測定的細菌分型方法，可用于多種細菌病原體的分型[9]。目前臨床關于來自于慢性肝硬化患者的泛耐藥鮑曼不動桿菌(XDRAB)分子流行病學特征相關報道較少。我們對62株XDRAB進行耐藥基因及菌株分型檢測，分析其分子流行病學特征，旨在為臨床防控XDRAB提供數據支持。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集本院2012～2015年間保存的62株XDRAB，均經BD公司全自動細菌鑒定儀phoenix100(Becton,Dickinson and Company)表型鑒定為AB，且均為XDRAB(對阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林舒巴坦、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟等臨床一線常用抗生素均耐藥，對多粘菌素B敏感)，質量控制菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。62株XDRAB均來自于慢性肝病患者，其中男46例、女16例，年齡16～88歲，其中>50歲41例、≤50歲21例；患者來自ICU 40例、內科病房14例、外科病房7例；肝病類型為肝硬化35例、藥物性肝損傷7例、肝移植術后6例、肝功能衰竭12例、肝癌2例；檢測標本來自于痰38例、血液9例、腹腔積液5例、膽汁3例、尿液2例；血清白細胞、中性粒細胞水平較高，淋巴細胞水平較低，血紅蛋白低;血清天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平高，白蛋白(ALB)水平低。本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 XDRAB菌株耐藥基因檢測 采用RT-PCR法。 取冷凍菌株，復蘇后提取DNA置于37 ℃培養箱培養18～24 h，挑取2～3個單個新鮮菌落，置于1.5 mL 離心管中,加入200 μL超純水，配置菌液濃度為0.5個麥氏濃度，100 ℃煮沸5 min， 12 000 r/min離心10 min。取上清，-20 ℃保存備用。AB碳青霉烯類耐藥OXA-51、OXA-23、GIM、OXA-58、IMP-R、VIM-2、OXA-24、VIM-1及SPMI基因的引物序列參照文獻[5]設計，PCR反應體系：TaqPCR Mix酶25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、DNA模板4 μL、超純水18 μL，反應條件為94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，30個循環后72 ℃、5 min。如菌株存在目的耐藥基因表達，視為菌株存在耐藥基因突變。

1.3 XDRAB菌株分型方法 采用MLST法。MLST應用于AB分型中時，常用基于保守區域305～513 bp序列的7個管家基因為gltA、 gyrB、 gdhB、recA、cpn60、 gpi和rpoD[10]。

取“2.2”中提取菌株DNA,擴增7個管家基因序列，測序后在GENEBANK中查找所對應的ST型,最終判定多態性分析的同源差異。7個管家基因片段經PCR擴增測序后，利用Blast算法同Pubmlst數據庫中AB數據進行比對(http://pubmlst.org/abaumamiii/)，從而確定每個基因的基因型，最后結合7個基因型確定菌株ST型。

2 結果

62株XDRAB菌株中均存在OXA-51、OXA-23、GIM基因表達。62株菌株中存在OXA-58、IMP-R、VIM-2、OXA-24、VIM-1及SPMI基因表達的分別為51、35、22、17、15、14株，未見存在SIM-1基因表達菌株。

62株菌株MLST分型為ST381型、ST425型、ST492型、ST464型、ST191型、ST208型、ST218型分別為15、12、11、7、6、4、1株，有6株菌株出現未知ST型依次以STx1～STx4命名，其中STx1型、STx2型、STx3型、STx4型分別為3、1、1、1株。

3 討論

近年來，頭孢他啶和頭孢噻肟、碳青霉烯和氟喹諾酮類等廣譜抗生素的頻繁使用與細菌病原體多藥耐藥性的增加有關[11]。碳青霉烯類抗生素以往被認為是治療嚴重AB感染的首選藥物。然而，碳青霉烯類耐藥的AB在世界各地頻繁出現。我們前期研究顯示，出現院內感染的AB菌株存在高碳青霉烯耐藥(亞胺培南和美羅培南耐藥率均達到100%)。碳青霉烯酶、MBLs和一些苯唑西林酶是公認的AB碳青霉烯耐藥的重要因素，OXA型碳青霉烯酶在耐藥AB中已經成為主流，尤其是在全球爆發的OXA-23、OXA-40也已經在歐洲和美國發現。而天然攜帶的OXA-51酶被用作AB的鑒定。此外，產生OXA-58的AB菌株在意大利、比利時、法國、希臘、伊朗、美國和阿根廷發現[12]。

AB具有強大的獲得抗生素耐藥性能力，多藥耐藥(MDR)甚至泛耐藥(XDR)的傾向給治療和感染控制提出了挑戰。在臺灣，XDRAB的患病率從2002年的1.3%增加到2010年的41.0%，2008年-2009年亞洲MDR-AB和XDR-AB的發生率分別為82%和51.1%[13]。在泰國清邁的一家醫院，在2005年XDR-AB感染的患病率是46.0%和在2008年XDR-AB 在外科ICU發生率30.6%[14]。由XDR-AB引起的VAP的發生率自2005年開始增加，直到2010年第1例在ICU中PDR-AB引起的VAP報道。MDR-AB感染的患者30天病死率是31.9%，而XDR-AB和PDR-AB死亡率分別增加到了56.8%和66.7%[15]。本研究中所有62株AB均對臨床一線常用抗生素均耐藥，包括：阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林舒巴坦、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星(CIP)、頭孢他啶、頭孢吡肟。但是，對多粘菌素B敏感。均為泛耐藥AB。

本研究中，62株XDRAB菌株對5類抗生素全部耐藥，僅對多粘菌素敏感。這稱為XDR，所有菌株有內在OXA-51基因，支持AB的鑒定，另外，OXA-23和GIM基因在所有的AB菌株中被發現，GIM基因與金屬β-內酰胺酶有關[16，17]。正如上面提到的，AB耐碳青霉烯常與β-內酰胺酶和MBLs有關在我們的研究中也得到證實。

耐碳青霉烯類抗生素的AB的出現被認為是臨床相關抗菌素耐藥性前哨事件。產生獲得碳青霉烯水解D類β-內酰胺酶，包括那些屬于OXA-23、OXA-24和OXA-58，并且固有的β-內酰胺酶OXA-51增加是最普遍的耐碳青霉烯耐藥機制[18]。OXA-23碳青霉烯酶基因的全球傳播與特定的克隆有關，主要是鮑曼不動桿菌MLST數據庫最大和最廣泛的克隆株ST492。攜帶OXA-23 的AB菌株屬于ST492已在許多國家被確定，包括澳大利亞、美國、中國、意大利、法國、塔希提島、越南、新喀里多尼亞、泰國和南非[19]。此外，AB攜帶OXA-51、OXA-58或OXA-40基因，但分型屬于ST492，已在日本、意大利和美國被報道[20]。本研究結果顯示62株菌株主要主要ST型為ST381、 ST425 和ST492。攜帶OXA-23、OXA-51和 GIM基因的XDRAB主要屬于ST381、ST425 和ST492三個基因型。ST492是可能導致AB對碳青霉烯類抗生素耐藥率高的菌株分型，本研究結果中，36株菌株中存在ST492及ST469克隆，且多數菌株存在ST492克隆(17/19,89.5%)，同時還有7株菌株MLST結果屬于新的STs型。這表明我院XDRAB主要流行菌株可能與其他地方不同。

肝病患者容易受到細菌感染是由于多種致病機制。腸道功能失調，細菌易位增加和免疫功能紊亂扮演重要的角色。細菌性腹膜炎和尿路感染是最常見的感染，還包括肺炎、皮膚和軟組織感染、菌血癥。肝病患者與感染的風險增加有關臨床特征包括肝功能差、靜脈曲張出血、低蛋白水平和住院治療[21]。失代償肝硬化患者細菌感染死亡的概率增加3.75倍，在1個月病死率達到30%，1年病死率63%。最近研究[22]報道,多個不同地區肝硬化患者耐藥細菌所致感染的患病率增加，耐藥細菌所致感染占院內感染23%～39%。本研究中，我們首對患者的臨床資料進行分析后發現，存在肝硬化的患者占多數(59.32%)，近半數數患者存在肝功能異常，ALB異常患者超過70%。因此，抵抗力低、免疫功能差的肝病患者XDRAB感染類型與其他患者也可能存在差異。

綜上所述，慢性肝病患者的XDRAB菌株主要耐藥基因為OXA-23、GIM、OXA-58 和IMP-R，均未出現SIM-1耐藥基因，主要ST型為ST381、ST425 和ST492。OXA-23、OXA-51和GIM基因是本院XDRAB介導臨床耐藥的主要基因型,因此我院應規范合理使用抗菌藥物，減少不必要的侵襲性操作，預防XDRAB的暴發流行。