慢性腎臟病腎陽虛證動物模型的研究與思考＊

鄭鵬飛，張新雪，趙宗江

（北京中醫藥大學中醫學院 北京 102488）

慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease，CKD）已成為21世紀人類健康所面對的重要挑戰。研究資料顯示，目前廣泛接受由KDOQI9和KDIGO11定義的慢性腎臟疾病（CKD）評估標準，系統性地估計CKD（包括1-5期）的全球患病率為3%-18%；而發表在柳葉刀的最新研究表明，截止到2040年，慢性腎臟病將成為第五大影響人類壽命的疾病[1]。我國流行病學調查顯示，20歲以上成年人CKD的患病率在10%左右。慢性腎臟病起病隱匿，一旦出現癥狀，病情已較為嚴重，病程難以逆轉，預后不良。近年來，由于社會發展、生活方式變化等原因，慢性腎臟病患者人數逐步增加，給國家和家庭帶來了沉重的負擔。

腎陽虛是慢性腎臟病中的常見而且重要的中醫證候，研究闡明慢性腎臟病中腎陽虛證的生物學基礎對于研究腎陽虛證的本質和發展中西醫結合治療慢性腎臟病具有重要意義。慢性腎臟病腎陽虛證動物模型可以客觀地、直觀地和定量地反映腎陽虛型慢性腎臟病病程中的生物學變化，揭示相關病證本質，為基礎研究和臨床治療提供科學依據。目前，國內慢性腎臟病腎陽虛證模型已經取得了一定成果，主要產生了化學藥物造模和復合因素造模兩類造模方法，并獲得了較為穩定的動物模型。但這些成果散在于實驗文獻中，缺乏對于模型制備和評價的系統研究，本文對這些模型文獻進行了匯總整理，從模型概述、模型制備、模型評價等方面進行分析與評價。分析了現有慢性腎臟病腎陽虛證造模方法存在的不足，并根據這些不足提出了進一步研究的思路與方法，以期構建標準化慢性腎臟病腎陽虛證動物模型。

1 慢性腎臟病腎陽虛證動物模型的研究現狀

腎陽虛證動物模型是最早建立的中醫證候動物模型，早在1963年，鄺安堃等[2]就采用氫化可的松建立了首個腎陽虛證動物模型。而隨著上海沈自尹院士等[3-9]開展的一系列針對腎虛證本質的研究，腎陽虛證的動物模型也隨之發展起來，時至今日其造模方法眾多，評價指標豐富且仍處于不斷進步之中。慢性腎臟病腎陽虛證動物模型是針對性在動物體內復制腎陽虛型慢性腎病病理變化本質的模型，但模型發展卻不盡如人意，造模方法有限，局限于特定的化學物質或手術方法，在模型評價上雖有一般狀況、腎臟病理和血尿生化等指標但缺乏綜合性和共識性的評價指標體系。我們采取文獻管理軟件與人工結合的方法，以限定“腎陽虛”、“慢性腎臟病∕慢性腎病”、“模型∕造模”，“CKD”等詞語為關鍵詞，在中國知網、萬方、維普、PUBMED等平臺對相關文獻進行檢索和篩選整理，在檢索獲得的橫跨1996-2018年的701篇文獻中，與腎陽虛型腎病或腎臟病理這一主題密切相關的文獻僅有20篇，占文獻總數的2.9%，且缺乏專門針對腎陽虛型慢性腎臟病的綜述性文獻。從客觀上反映了目前本病證模型發展所面臨的局限。

1.1 慢性腎臟病腎陽虛證動物模型的造模方法

目前文獻報道的動物模型造模方法僅有四種，兩種為使用單一藥物造模，一種為使用復合藥物造模，一種造模方法為藥物配合手術進行。

1.1.1 化學藥物造模

1.1.1.1 腺嘌呤

傅氏等[10]將腺嘌呤制成混懸液后以200 mg·kg-1劑量每日定時灌胃給藥，給藥時間從第1天到第12天每日給藥，從第12天后隔日給藥直到第24天造模結束。操氏等[11]以腺嘌呤250 mg·kg-1給大鼠灌胃一個月。劉氏[12]等則在每日上午以10 mg·kg-1·d-1定時灌胃，持續21天。宋氏等[13]以200 mg·kg-1·d-1為標準，大鼠10 mL·kg-1·d-1將腺嘌呤以蒸餾水配制為2%的溶液在每日上午進行灌胃，同樣持續21天。此外，還有其他人應用腺嘌呤方法制備模型[14-16]。

1.1.1.2 阿霉素

趙氏[17]比較了單純注射阿霉素、左腎3∕4切除或全切合并阿霉素注射造模的方法，認為單純注射阿霉素更符合腎陽虛表現。

1.1.2 復合因素造模

1.1.2.1 不同藥物組合造模

王氏等[18]采取先分別以4 mg·kg-1和3.5 mg·kg-1兩次尾靜脈注射阿霉素制備水腫模型再以每日定時肌注氫化可的松的方式建立大鼠腎陽虛水腫模型。葉氏等[19]對阿霉素腎病腎陽虛證模型進行評價，采用一次性尾靜脈注射阿霉素5 mg·kg-1再定時臀部肌注氫化可的松25 mg·kg-1的方式制備模型。

1.1.2.2 藥物手術組合造模

孫氏[20]等報道使用丙硫嘧啶配合5∕6腎切除制備慢性腎衰腎陽虛模型。

1.2 慢性腎臟病腎陽虛證動物模型的評價方法

通過文獻整理可以發現，目前慢性腎臟病腎陽虛證動物模型較為缺乏針對性強的評價方法與檢測指標，主要為參考腎陽虛證模型評價附加腎臟疾病特有的部分指標。上述造模方法主要是采取動物出現體重減輕、畏寒、蜷縮弓背、反應降低、毛發稀疏等符合腎陽虛表現的狀態作為界定證候造模成功的標志[10,12-16]，部分作者采取的是證候表現復合特定生化指標作為界定[17-19]，個別作者采取的是形態學復合生化指標[11]或證候表現復合藥物反證[20]的方式。

具體評價方法和指標主要有以下幾方面：

1.2.1 癥狀體征

包括對大鼠的體重體態，皮毛色澤，精神狀態，活動狀況，飲食飲水，體溫，排泄，耳廓∕口鼻∕肛周等進行觀察，此外還有引入抓力等作為觀察指標的研究[16]。

1.2.2 生化指標

主要由血液生化和尿液生化指標組成。血液主要有尿素氮，肌酐，尿酸，總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白與低密度脂蛋白，cAMP∕cGMP[17-18]等，此外還有靶腺軸指標如下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸的甲狀腺T3∕T4、下丘腦-垂體-性腺（HPGA）軸的雌二醇和睪酮[18]以及下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸指標ACTH、CORT和17-OHCS[16]，水通道蛋白AQP1，2[12,16]。尿液指標主要是尿液生化分析和24h尿蛋白定量。

1.2.3 腎臟病理

主要有以下幾方面，腎臟大體形態觀察：腎臟外觀，腎臟色澤，腎臟包膜，腎臟皮質髓質交界與色澤。腎臟光鏡觀察，主要觀察腎小球與腎小管結構與腎間質結構，包括腎小體數量，腎小球萎縮情況，腎小管擴張情況，上皮細胞病變，纖維組織增生與炎性細胞浸潤等。腎臟電鏡觀察，包括對腎小球腎小管的結構和上皮細胞細胞器的觀察[10]。

1.3 慢性腎臟病腎陽虛證動物模型的應用

目前，慢性腎臟病腎陽虛證動物模型主要有兩方面應用：首先是病證結合模型研究，即西醫的辨病與中醫的辨證相結合。研究腎臟疾病與中醫證型腎陽虛證的病理表現與模型研制。其次是研究中藥與中藥復方對于腎陽虛型慢性腎臟病的干預作用，如研究真武湯、右歸飲對于腎陽虛型慢性腎衰的干預作用。兩者緊密聯系，前者為后者提供了模型試驗基礎，后者的成功運用則反過來推進了相關模型評價指標等方面的發展。當然腎陽虛腎臟病動物模型有待于進一步拓展應用范圍，挖掘應用深度，并與其他領域相結合，體現其學術價值。

1.4 慢性腎臟病腎陽虛證動物模型存在的問題

目前，通過現有的文獻整理表明：慢性腎臟病腎陽虛證動物模型存在以下問題：（1）構建方法少（藥物灌胃或注射、手術），具體造模方式主要采用病理造模方法如藥物注射方式，個別采取藥物配合腎切除的復合造模，而造模藥物也局限于腺嘌呤、阿霉素與氫化可的松三種藥物，且應用已經達到達二十年左右，難以見到其他藥物的使用；（2）模型評價方式較為簡單，主流是直觀反映中醫證型的一般狀況與反映病理機制的生化組織學相結合，這種評價體系已經有多年歷史，雖然能在一定程度上起到病證結合、反映疾病的病理機制的作用，但存在創新性不足，而且評價指標較為簡單，比如認為動物出現一定癥狀表現即認為造模成功，而這種評價方式容易受到主觀因素的干擾而損害可靠性，因此整體評價體系有待充實；（3）對于證候本質的深入研究不足，與腎陽虛證候有關的特異性標志物檢測引入少，多為臨床常見生化指標，分子生物學層面特別是組學研究參與不足；（4）與病理造模方法對應的中醫病因造模方法更是未見到文獻報道，中醫證候因素參與明顯不足。隨著醫學研究的不斷深入，對于動物模型能夠復刻人類疾病的還原程度以及對于中醫證候本質認識的要求也不斷提高，而滯后的造模方法嚴重阻礙了對疾病本質的研究探索。

2 標準化慢性腎臟病腎陽虛證動物模型的構建與評價

2.1 對慢性腎臟病腎陽虛證動物模型構建的思考

2.1.1 動物模型的構建

慢性腎臟病腎陽虛證動物模型，顧名思義，除了“慢性腎臟病”之外還有“腎陽虛證”，即中醫證候表現。作為病證結合模型，在目前的模型構建中，主要著眼于現代醫學的病理表現，而對于引入中醫證候因素則存在不足。單純的采用以藥物模擬腎陽虛證表現，雖然可以再現陽虛證候，但實際上中醫證候發展是一個多變而復雜的過程，單純采用藥物模擬可能并不能完全真實反映中醫證候的發生發展,難以將“病”與“證”有機結合，采用復合因素，盡可能還原真實疾病情況與模擬病因病機制備模型可能是更加理想的選擇。在造模方式上，可以考慮參考腎陽虛證本證的造模方式，不單獨使用藥物從現代醫學腎損害的角度來造模，還要從中醫病因病機上入手，加入能體現中醫思想并能在一定程度上量化的方式對腎陽虛證的病因病機進行模擬，從而達到還原真實疾病發生發展的目的。

2.1.2 作者團隊的探索

在本團隊的實際研究中，采取基礎疾病合并復合因素的造模思路。即首先采用阿霉素尾靜脈注射方式制備慢性腎臟病模型，阿霉素腎病模型其原理是阿霉素損害腎臟足細胞，腎小球出現節段性硬化，腎小管變形，呈現大量蛋白尿，在疾病表現上較為接近人類腎病綜合征，隨著阿霉素腎病的發展，大量蛋白的丟失，模型本身即有可能出現腎陽虛證的表現，隨后采取增加復合因素二次造模的方式，復合因素參考腎陽虛證模型制備方法，如引入氫化可的松、羥基脲、他巴唑等藥物方式，在保持模型動物器官完整的情況下利用藥物誘導動物出現腎陽虛證的表現，最后篩選獲得最符合要求的慢性腎臟病腎陽虛證動物模型。這種造模方式優點在于：首先，不通過手術造模，保持實驗動物組織與器官完整，符合臨床大多數患者雙腎保存的實際，也可以規避手術對動物造成的不必要損傷與死亡；其次，采取阿霉素腎病作為基礎慢性腎臟病模型，可以較好地模擬人類慢性腎臟病疾病表現，并隨病程發展逐漸出現腎陽虛的癥狀；再者引入其他腎陽虛證造模藥物，可以提高模型成功率，并且這些藥物作用的靶器官表現可以一定程度上模擬慢性腎臟病后期機體多器官多系統受累的表現，從而再現陽虛證的多種證候表現；最后，通過這種多復合因素并行比較的方式，可以從現有的多種造模方式中篩選出最符合人類慢性腎臟病腎陽虛證表現的造模因素，進而建立標準化動物模型制備標準。而對于模型的評價，采取中醫證候評分量表、臨床生化指標檢測、特異性靶腺軸標志物檢測與組學指標檢測，以及中藥方劑反證方式相結合的評價體系，從而盡可能的全面準確把握慢性腎臟病腎陽虛證的證候與其本質。

2.2 對慢性腎臟病腎陽虛證模型評價方式的思考

2.2.1 評價指標

2.2.1.1 特異性指標的充實

在上文實驗指標部分中，癥狀體征，靶腺軸指標和代謝指標cAMP∕cGMP屬于常用的腎陽虛證的特異性指標，而其他指標大部分是CKD常規病理指標。有文獻顯示，慢性腎臟病標證以濕熱、瘀血為主，本虛證包括脾腎氣虛、肺腎氣虛、脾腎陽虛證等[21-22]。而對這些證型的認定，目前根據文獻總結來看仍以臨床證候為主，對于中醫證型對應生化指標研究仍以常規臨床檢驗指標為主，如上海龍華醫院對中醫證型與實驗室指標關系進行了研究，研究采用的指標均為臨床常用指標[23]。而要完善模型的評價方式，確定模型證候是否符合造模要求，只有臨床常規指標尚不能滿足，需要在評價指標中增加靶腺軸等特異性指標的項目比重，從多個特異性位點進行評價，這樣才能全面準確地評價模型。

2.2.1.2 新指標的引入

在新指標的引入上，目前在腎陽虛模型中已經廣泛引入代謝組學等研究方法，并發現在腎陽虛證中在能量代謝、氨基酸和脂肪酸代謝上存在變化。比如關氏等[24]運用液質聯用技術對CKDⅠ-Ⅴ期分期患者和健康人血漿代謝物進行分析，發現不同階段CKD患者血漿標本存在明顯差異,在血漿中找到鞘氨醇、牛磺酸、原卟啉Ⅸ等27個差異化合物。認為不同階段CKD患者血漿中膽紅素循環、鞘脂類代謝、類固醇類代謝等通路出現紊亂。李氏等[25]進行慢性腎衰竭早中期慢性腎衰竭患者血清代謝分析，發現與健康人血清相比較，精氨酸、脯氨酸、乙酸、谷氨酸、三甲胺、丙三醇、苯丙氨酸、乳酸等含量明顯上升；檸檬酸、丙三醇磷酰膽堿、甘氨酸、α-葡萄糖、三甲銨乙內酯含量明顯下降。林氏[26]等用血清蛋白質組學對糖尿病慢性腎臟疾病致病因子和早期診斷指標進行探索發現：MASP2、前凝血酶原、Igα1鏈C區段等與CKD的發生發展有關，由此認為臨床血清蛋白質組學可作為CKD診斷有效研究手段。謝氏[27]對CKD4期不同證候及證候演變過程中脂質代謝物異常分析后得出結論：脾腎氣虛兼濕濁瘀阻證、脾腎氣虛、濕濁瘀阻兼濕熱證的發展伴隨eGFR降低，兩組證候潛在脂質標志物主要是溶血性磷脂、磷脂和鞘脂。這些代謝組學結果可以反映機體內實時的代謝變化，與證候的發生發展具有同步性。但這些組學研究在慢性腎臟病腎陽虛證模型評價中卻未見到相關報道。一些隨著現代研究不斷深入被挖掘的新指標新位點也極少體現在現行模型評價體系中，阻滯了對中醫證型下疾病機制的揭示，這是發展腎陽虛腎病模型迫切需要解決的問題。

2.2.2 評價體系

2.2.2.1 整體評價體系的構建

在腎病模型的評價方式這一問題上，首先應對現有評價體系進行回顧，篩選針對性強的評價方式，在證候上選擇表現明顯，區分度好，有量化可能，并符合臨床表現的證候。在生化指標上，增加特異性生化指標內容，特別是已經在實驗中獲得證實的靶腺軸指標應該作為常規評價方式。然后要建立非單一評價方式，對模型成模與否進行全面綜合的評價。應注意考慮引入腎陽虛證的相關分子生物學評價指標，特別是代謝組學、蛋白組學、基因組學這三大組學，這些組學研究極大地推動了對于疾病證候的物質基礎的認識，因此作為揭示疾病物質基礎的重要手段，組學研究在慢性腎臟病腎陽虛證模型的評價體系中應是重要的組成部分。再有不可忽視從中醫理論出發，根據腎的生理病理特點以及臟腑關系思考引入腎系以外的臟腑體系評價。最后，還應加入藥物反證的內容。觀察模型動物對證候對應方藥的反應是驗證模型是否符合所研究證候的重要方式。

2.2.2.2 腎外藏象評價體系

無論是慢性腎臟病還是腎陽虛證，都是全身綜合性的病證，波及全身除腎外的多個臟腑器官。因此有必要考慮引入腎系之外的藏象評價。舉例來說，腎具有主藏精、主水、主納氣的生理功能，腎陽可以推動和激發臟腑的各種機能，溫煦全身臟腑形體官竅，推動和調控機體新陳代謝的過程，腎陽虛衰則臟腑機能減退。臨床上與腎陽衰退有關的臟腑兼證常可見心腎陽虛和脾腎陽虛，表現除了腎系病癥之外的心系和脾系癥狀，如心悸、胸悶、畏寒、腹瀉等。而腎陽虛衰氣化不利，則腎氣衰弱攝納無力，呼多吸少，表現出肺系癥狀。這些腎外臟腑的病理表現乃至病理生化指標也可以考慮作為參考，但也要把握證型之間的分界。當然，腎外藏象體系的評價還需要更多的臨床與實驗數據來支持。總而言之，打開思路，擴大視野，深挖內涵才能建立全面可靠的模型評價體系。

3 總結與展望

慢性腎臟病腎陽虛證模型對于揭示腎臟疾病與“腎陽虛證”的物質基礎，探索治療手段有著重要意義。但從文獻來看，慢性腎臟病腎陽虛證模型一直以來缺乏系統的分析與研究。本文首次對慢性腎臟病腎陽虛證模型的文獻進行了整理，總結了目前本模型的造模方法、評價指標與應用意義。同時也提出了目前模型存在的問題，討論了可能的改進空間。當前模型發展的主要問題有：模型缺乏規范化；造模因素單一；模型成模缺乏公認可靠的判斷標準；科學量化的生化與分子生物學指標體系不足等。在本團隊的研究工作中，采用反復論證后確定的復合因素進行造模的動物已經表現出一系列陽虛證候，并為此制作了專門的分級量表進行量化處理，同時取材收集了動物的血清和多種靶器官組織進行了一系列靶腺軸與代謝物生化指標檢測，后續還將開展三大組學的研究。因此，這一領域后續的研究，應該包括合理選擇造模動物，規范和創新性造模方式，應用復合因素造模以及建立全面深入的動物模型評價體系，從而建立符合中醫理論與臨床實際的動物模型，這也是對于中醫證候研究的重要補充和促進。