外泌體與缺血性腦卒中及針灸干預機制＊

李巧鳳，彭擁軍＊＊，李忠仁，洪 浩，儲繼紅，蔡 云

（1.南京中醫藥大學附屬醫院 南京 210029；2.南京中醫藥大學 南京 210029）

缺血性腦卒中（ischemic stroke,IS），中醫稱為“中風”，以猝然昏仆，口舌歪斜，半身不遂，語言不利為主癥。IS因腦組織局部供血不足，導致組織缺血缺氧，甚至軟化壞死，以神經功能缺損為主要表現。中風致死率僅次于心臟病、癌癥、慢性下呼吸道疾病和意外傷害[1]，是發病率、致殘率、死亡率較高的疾病。目前IS的治療最有效的方法為發病后4.5-6個小時內進行溶栓、機械取栓[2]，此方法時間窗較短，很難把握住治療時機，能夠及時接受到有效治療并改善神經功能的患者極少，且溶栓后的治療效果可能不佳，患者神經功能缺損的癥狀仍可能存在，甚至出現其他嚴重并發癥。如何早期診斷、早期治療是有效改善缺血性腦卒中癥狀亟需解決的問題。而外泌體作為新型標志物對IS的作用及針灸對外泌體的影響將有助于IS患者的早期診斷、早期治療。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的形態結構

關于外泌體（exosomes,EXs）的描述最早在1983年，外泌體是一種包含大量細胞表面受體的多種細胞類型產生的復雜“活躍”結構，目前被歸類為細胞外囊泡（extracellular vesicles,EV）類的一種，而外泌體尤其是指50-200 nm的微小EV，胞內體內陷形成多囊泡體（multivesicular bodies,MVBS）與細胞膜融合釋放出的囊泡即為外泌體，內含蛋白質、營養因子、微小核糖核酸（microRNAs，miRNA）等結構，且因其不被網狀內皮組織系統細胞內吞，可通過與靶細胞受體結合，高效運送這些生物信息物質到達靶器官[3]。

外泌體水平轉移內容物到靶器官中發揮與所攜帶的活性物質同樣的功效，甚至更好的治療作用。例如，Manuel等[4]對大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠右股靜脈注射間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）及MSC源性外泌體，結果顯示了兩者的血小板-內皮細胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）及5-溴脫氧尿核苷（bromodeoxyuridine,Brdu）融合的細胞數量顯著增加，二者具有促進血管生成的作用，表明外泌體與其祖細胞具有相似的作用。因此外泌體在介導細胞間通訊中具有重要意義，并且發揮與其來源母細胞相同的功能。

1.2 外泌體的功能

外泌體的功能主要表現在免疫中抗原呈遞、損傷組織修復、神經保護、促進髓鞘再生、血管新生等方面[5]。外泌體參與缺血性腦卒中后腦損傷的修復功能[6]，其發揮功效的最大優勢是通過血腦屏障不被降解[7]，血腦屏障是血漿和腦脊液間的生理屏障，選擇性的轉運特定分子，限制98%[8]的小分子物質和幾乎所有大分子物質透過血腦屏障，嚴格控制腦實質與外界細胞間的物質交換，以保持腦組織內環境的基本穩定。

另外，研究證實血液和腦組織的外泌體源性miRNA存在顯著相關性，二者隨同變化，提示腦組織發生缺血性損傷后血腦屏障被破壞，損傷的腦組織外泌體源性miRNA（exogenous miRNAs,exo-miRNAs）透過血腦屏障釋放到循環血液中[9]，因此缺血性腦組織中高表達的exo-miRNAs也存在于血液中，可以反映中樞神經系統狀態的信息,為利用血漿外泌體診治IS提供了臨床應用的前提與基礎，從而介導大腦對中風后體內微環境進行一系列應答和處理。

2 外泌體有助于IS的診斷

IS的傳統診斷主要依據影像學檢查，利用血液檢驗手段診斷IS尚缺少特異性的生物標志物。如何尋找敏感客觀的分子指標對IS進行早期準確、安全高效的診斷，是推進IS精準診斷與個體化治療亟需解決的問題。而外泌體的高靈敏度、穩定性、特異性、高效運送性及易得性的特性恰好是外泌體對腦卒中進行精準診斷的優勢所在。近年來，外泌體源性miRNA作為IS的新型診斷標志物得到了越來越多的研究關注。

2.1 miRNA與外泌體源性miRNA的相關性

miRNA是一類生物體內自然生成的長度約21-23 nt的單鏈非編碼核糖核酸（ribose nucleic acid,RNA），具有轉錄后調控基因表達的功能，作為細胞間通訊的重要介導物質[6]，被認為是組織損傷的敏感血漿生物標志物[10]，近年來發現miR-223[11]、miR-124[12]、miR-9、miR-126、miR-210、miR-221等[13]與缺血性腦卒中有關，且這些miRNA主要聚集于外泌體并且通過外泌體在細胞之間交換[14]，在靶器官內發揮其特定的生物學功能，因此外泌體可以通過水平轉移miRNA，介導大腦中的細胞間信號，反應IS的病理狀態。由于外泌體是通過選擇性的方式分泌到細胞外空間的，因此外泌體miRNA被認為是比血清miRNA更為敏感和具有特異性的生物標志物。

2.2 外泌體miR-223、miR-124、miR-9有望成為IS的特異性診斷標志物

Chen等[15]收集了50名急性缺血性卒中患者在發病初72小時內的血液樣本，檢測外泌體miR-223和miR-16水平，與健康者相比外泌體miR-16水平相差甚微，而miR-223的含量增加顯著，受體工作特征曲線顯示當exo-miR-223=-0.50時，曲線下面積為0.859，最佳靈敏度為84.0%，特異性78.8%。且exomiR-223與美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）評分呈正相關，并且觀察到預后較差的卒中患者外周血exo-miR-223表達高于有良好預后的卒中患者，提示相比于exomiR-16，exo-miR-223的表達與卒中嚴重程度和短期預后相關性更大。

外泌體中的miR-124廣泛分布在大腦各區域，是大腦中最豐富的miRNA,Ji等[16]采集了65名急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者和66名健康者的血清外泌體，與對照組相比，卒中組血清外泌體濃度顯著升高，exo-miR-9和exo-miR-124的水平增加與NIHSS評分、梗塞體積和促炎細胞因子白細胞介素-6（interleukin，IL-6）的過度表達呈正相關,且二者曲線下面積分別為0.8026和0.6976，表明血清外泌體miR-9和miR-124是診斷AIS的特異性生物標志物，且miR-9比miR-124具有更高的特異性。

外泌體miR-223、miR-124、miR-9是診斷缺血性腦卒中和評估腦組織損傷程度的潛在生物標志物。

3 外泌體對于IS的治療作用

外泌體因其來源母細胞不同具有不同的組成成分和功能。多個研究表明外泌體源性miRNA和mRNA網絡在介導大腦修復過程中發揮關鍵作用[17]。Mirzaei等[18]發現中風中組織特異性miRNA中有43個上調，36個下調，其發揮著各自的作用：①神經保護：Let-7，miR-181，miR-200，miR-182，miR-124，miR-134；②髓鞘再生：miR-17-92,miR-145；③促進血管新生：miR-210,miR-222,miR-424,miR-126,miR-130a,miR-378。

3.1 外泌體具有神經保護作用

外泌體在穩定基因組和突觸可塑性以及維持與神經發育過程有關的時空梯度方面有一定作用。外泌體可以通過誘導RNA、蛋白質影響缺血性腦重塑過程以發揮神經保護作用。例如，外泌體的miR-124可以促進皮質神經前體細胞在梗塞部位獲得神經元表型，從而促進神經保護及修復以改善腦損傷[7]。內皮細胞源性外泌體具有抑制細胞凋亡、促進細胞生長遷移的作用，直接保護神經細胞免受缺血再灌注損傷[19]。

Putz等[20]實驗發現泛素連接酶（Neuronal precursor cell developmentally downregulated 4，Nedd4）家族相互作用蛋白1（Family interacting protein 1，Ndfip1）存在于轉染的人源胚胎腎細胞293（human emborynic kidney 293T，HEK293T）細胞和未轉染的原代皮質神經元的外泌體中，對神經元保護有積極作用，Ndfip1還可作為外泌體內膜結合蛋白轉運至細胞外環境，在神經元損傷期間，大量有害物質在神經元內外積聚，誘導細胞死亡，Ndfip1的表達增加導致外泌體中泛素化蛋白的積累，從而高效隔離和去除毒性物質，改善神經元存活。

MSC是能夠促進血管新生的多向分化性成體干細胞[21],被稱作“藥物信號細胞”[22]。MSC釋放的外泌體中的miR-133b下調結締組織生長因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）表達和大鼠肉瘤同源基因家族A（rat sarcoma homolog gene family member A,RhoA）蛋白表達，前者被認為是軸突再生障礙的一個因子，后者為影響神經元形態發育的關鍵調節因子并且可影響神經突的可塑性，改善MCAO大鼠的中風癥狀[23]。

3.2 外泌體發揮髓鞘再生作用

Xin等[24]對MCAO大鼠靜脈注射大量的Exo-miR-17-92，激活亞型3-激酶∕蛋白激酶B∕亞型靶蛋白信號通路（Phosphatidylinositol 3-hydroxykinase∕protein kinase∕mammalian target of rapamycin,PI3K∕Akt∕mTOR），該通路是調節細胞增殖、生長、分化、生存的重要通路[25]，以使糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）失活，GSK-3β在成人腦內廣泛表達，參與細胞的增殖、遷移、分化、神經母細胞和神經元的可塑性[26]，腦梗時該通路被抑制，Exo-miR-17-92激活該通路，使PI3K-AKT通過mTOR途徑促進軸突局部蛋白質的合成，使GSK-3β的失活，促進了中樞神經系統的髓鞘再生。

Pusic等[27]將干擾素γ（interferon-γ,IFN-γ）誘導下的樹突細胞（dendritic cells，DC）外泌體經鼻給藥，在被少突膠質細胞攝取后，發現參與少突膠質細胞分化和抗炎途徑的特異性miRNA在IFNγ-DC-Exos中高度表 達，特 別 是miR-219、miR-181a，miR-451，miR-532-5p和miR-665高度集中，結果證實FNγ-DC-Exos可以有效增加腦髓鞘的形成和氧化耐受，促進急性脫髓鞘后的髓鞘再生。

另外，雪旺細胞通過分泌外泌體的形式促進P75神經營養因子受體（P75 neurotrophic receptor,P75NTR）分泌，從而促進軸突再生。雪旺細胞是神經膠質細胞，p75NTR屬于I型跨膜糖蛋白，能與眾多神經營養因子及神經營養因子前體結合。雪旺細胞外泌體中富含p75NTR，通過拮抗神經突生長抑制因子受體（Neurite outgrowth inhibitor receptor，NgR）信號通路使抑制分子的分泌減少，促進軸突再生[28]。

3.3 外泌體促進血管新生

血管新生是外泌體眾多作用中至為重要的一個作用，血管新生即從現有的血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）增殖、遷移至微血管床上，產生新的血管，以便向各種器官和組織提供營養物質和氧氣，它既是正常的生理過程，也是應對神經系統疾病的一種自然防御反應[29]。重建功能性腦微血管網絡將改善局部血液供應并促進中風恢復。

外泌體的促血管再生機制可能與下列因素有關：①缺 氧 誘 導 因 子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）缺氧條件下過表達供體使外泌體分泌能力增強；②外泌體通過激活細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）∕Akt信號活化血管內皮細胞，血管內皮細胞分泌細胞外基質和血管再生因子，增強表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表達和激活ERK1∕2信號通路，促進局部血管形成；③具有促血管生成功能的microRNA在缺血環境下在外泌體中高表達提高血管生成能力；④Notch的主要配體Jagged1誘導血管再生；⑤NO釋放聚合物可以促進外泌體的促血管生成成分，增強血管生成作用[30]。HIF-VEGF-Notch信號通路貫穿血管新生過程的始終，在外泌體發揮血管生成作用中起到重要作用。

miRNAs是血管生成的關鍵調節因子，外泌體通過轉載miRNA激活PI3K∕Akt信號通路，增加腦血管周細胞內皮生長因子（VEGF）的miRNA和蛋白質水平導致血管生成，在VEGF的誘導下進一步激活Notch信號傳導通路，以使血管屏障能夠保持完整性[31]，例如MSC-EXs中miR-132-3p作為一種具有血管再生作用的特異性miRNA，其在缺氧∕復氧誘導下表達上調，激活PI3K∕Akt信號通路，修復受損腦血管內皮細胞的血管再生、增殖、遷移能力及Akt磷酸化水平，內皮細胞誘導毛細血管網絡結構[32]，表明外泌體有助于觀察中風后腦修復過程中神經發生和血管生成的耦合，促進中風后的功能恢復。

此外，局灶性腦缺血小鼠模型中腦血管的miRNA-15a的下調能夠增加VEGF，促進梗死周圍區的血管生成并且誘導VEGF與神經前體細胞中的VEGFR2相互作用，改善神經組織結構，促進血管增殖和神經元分化[23]。Horie等[33]通過人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的體外血管生成測定揭示了碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9,CA9）外泌體具有促進血管遷移和形成的作用，在缺氧刺激下激活HIF1，分泌缺氧誘導基因CA9，上調基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）表達，MMP2是一種促血管生長因子，外泌體高表達MMP2,增強血管生成作用，提供營養物質和氧氣，維持細胞存活。

血管生成的程度通常與腦梗塞減少和神經恢復改善密切相關，因此，促進缺血后血管生成是臨床環境中治療急性缺血性中風的重要治療策略。外泌體發揮促血管作用的機制可能是通過調節HIF-VEGFNotch信號通路表達，外泌體miRNA可能參與調控該通路來促進血管新生。

4 針灸對外泌體的影響有助于探究針灸治療IS的新機制

目前針灸治療IS的機制主要認為通過擴張血管、改善血液流變性，增加側支循環，改善腦部血液供應，降低血液黏稠度，促進環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）分泌，降低一氧化氮的神經毒性，抑制細胞的調亡，減輕自由基損傷和脂質過氧化反應，控制鈣超載等機制進行干預治療[34]。針灸對外泌體的影響將有助于進一步研究針灸的腦保護機制，并且將針灸治療精準化便捷化，從而指導針灸臨床實踐。

針刺刺激肥大細胞釋放出外泌體，外泌體能夠刺激淋巴細胞，增強針刺免疫調節的效果，且肥大細胞多集中于穴位，主要分布在毛細血管和周圍神經，在針刺反應下，肥大細胞沿神經傳遞信息，興奮局部傳入神經，外泌體也能刺激神經末梢釋放肽物質（substance p,SP），反饋到肥大細胞，進一步刺激肥大細胞釋放免疫活性物質，促進針刺局部位點的神經免疫調節[35]，這是導致針灸有效性的關鍵因素之一。

Su等[36]對經針刺結合低頻電刺激和未予刺激的小鼠血清中的外泌體進行了miRNAs測序，發現34種microRNAs發生改變，其中miR-181d-5p的含量增加明顯，而它可以作用于瞬時受體電位離子通道蛋白7抗體（transient receptor potential melastain 7,TRPM7）[37]，TRPM7在神經系統分布廣泛，是一種雙功能蛋白，具有陽離子通道和蛋白激酶雙重結構，與血管損傷的關系密切，腦組織在缺血缺氧情況下，鈣離子大量內流，導致細胞內鈣超載，導致神經元興奮毒性，TRPM7對鈣鎂等陽離子具有較高滲透性，維持細胞內陽離子穩態，通過調節鈣鎂離子的平衡而達到保護神經元的作用[38]。針刺促進外泌體分泌激發TRPM7，促進氧糖剝奪后腦微血管內皮細胞的遷移和血管生成，對IS患者的腦部血液供應及神經元保護具有重要作用。

Liu等[39]用電針刺激曲池和足三里，發現電針（electric acupuncture,EA）組梗死周圍皮質中miR-9的表達增加，核因子kB（Nuclear factor kappa beta,NFkB）信號通路相關因子NF-kBp65，腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor,TNF）-α和IL-1β減少。NF-kB是最重要的核轉錄因子之一[40]，當腦梗死發生時NFkB抑制蛋白（inhibitor of NF-kB,IkB）可被IkB激酶磷酸化激活，NF-kB活化移位，部分腦細胞發生異常變化，導致下游多種促炎細胞因子分泌，損傷動脈血管內皮，腦組織血流灌注減少，缺血缺氧程度加重，最終導致腦血管閉塞。電針可以調節miR-9介導的NFkB信號傳導途徑并減少促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，改善腦卒中患者的腦血流灌注。

另外，電針還可以通過下調miR-449a表達促進神經干細胞的增殖和神經元的存活，miR-449在腦梗死患者的血清中較健康者的水平高，miR-499和血清C反應蛋白呈正相關，并且能夠促進神經干細胞生物標志物巢蛋白、神經元特異性核蛋白、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）的表達顯著增加，前者作為成熟神經元的特異性標志物，后者與神經再生密切相關[41]，電針刺激減少miR-449的表達，有助于受損腦神經的恢復。

因此電針可以促進作為細胞間通信介質的外泌體的分泌，在治療過程中起積極作用，以調節外泌體所攜帶的活性因子、miRNA等物質數量表達的方式，有效改善IS的臨床癥狀。

5 小結與展望

外泌體因其具有穿過血腦屏障的獨特性以及分布廣泛的特點在IS的應用中具有極大潛能，對腦組織損傷具有神經保護及修復、促進髓鞘再生、血管新生等作用，但目前關于外泌體的研究大多局限在miRNA領域，其他外泌體分泌物研究較少，關于外泌體中各種生物活性物質的相互作用及靶向運輸的通路調控機制及高精度的外泌體分離提純的方式還不完善，而針灸因其穩定性、安全性、簡便性被廣泛應用于IS的治療中，它對于外泌體活性物質有調節作用，然而具體機制尚不清楚，相關實驗文獻較少。電針對于外泌體的作用與特定穴位之間的關聯也有待考究。進一步開展有關實驗，有助于研究電針對外泌體的影響，從而指導針灸臨床實踐。