一株凝結芽孢桿菌的分離鑒定及益生性分析

陳秀秀，孫洪浩，孫小涵，呂福軍

（遼寧波爾萊特農牧實業有限公司，沈陽 110000）

2020年7月1日起，隨著中國全面進入飼料無抗新時代，各種替抗產品層出不窮，益生菌是替抗產品中最具發展潛力的飼料添加劑之一。益生菌的優點主要體現在幾個方面：一是發酵過程中產生大量酶類，促進營養物質吸收提高飼料轉化率；二是促進蛋白和維生素的生成和代謝；三是抑制腸道內致病菌的繁殖，促進有益菌的生長，維持腸道微生物的動態平衡；四是調節動物機體的免疫功能；五是減少動物糞便中的刺激氣體的產生凈化空氣減少污染[1]。

凝結芽孢桿菌作為可以形成芽孢的益生乳酸菌，在2013年被農業農村部正式列入《飼料添加劑品種目錄》。凝結芽孢桿菌作為新型微生態制劑，因其既具有芽孢桿菌的特點，還具有乳酸菌的優勢，已被廣泛應用于食品、畜牧業、醫藥行業、水產養殖業。本研究評價了凝結芽孢桿菌G4 菌株的生長曲線、抑菌性、耐抗生素能力、產酶能力、產酸能力等益生性指標，旨在為凝結芽孢桿菌作為飼用添加劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康仔豬腸道內容物；金黃色葡萄球菌（SA）、大腸埃希氏菌（K88）由本實驗室保存；MRS 培養基、MRS 肉湯、營養瓊脂、營養肉湯均購自北京陸橋技術股份有限公司；生化鑒定所用試劑購自青島海博生物科技有限公司；乳酸試劑盒及各種酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所，抗生素藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 菌株分離純化

取5 g樣品于100 mL富集培養基中，37 ℃培養24 h。富集液80 ℃水浴作用20 min，梯度稀釋，MRS 培養基傾注37 ℃培養48 h。挑取疑似單菌落進行3 次平板劃線純化菌株，將分離純化的菌株于-80 ℃保存備用。

1.3 菌株生化鑒定

1.3.1 生化鑒定

根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》，對分離菌株進行明膠液化、55 ℃生長、吲哚試驗、7%氯化鈉生長、V-P 試驗、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、酪氨酸水解、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇發酵和溶菌酶生長等生化試驗。

1.3.2 16S rDNA序列測定

細菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA，引物16S rDNA 通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATC?MTGGCTCAG-3'和1492 R：5'- TACGGYTACCTT?GTTACGACTT-3'進 行PCR 擴 增。16SrDNA 的PCR 擴增體系（30 μL）：Super Mix 15 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板DNA（ng·μL-1）1 μL、ddH2O 12 μL。PCR 反應程序：96 ℃預變性5 min；96 ℃變性20 s， 62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；72 ℃最終延伸10 min；PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，將有目的條帶的PCR 產物送北京六合華大基因科技有限公司進行測序。將所得序列與GenBank 中序列進行Blast 分析比較，用Mega 6.0軟件構建系統發育樹。

1.4 生長曲線及pH曲線

菌種活化后，1%接種量接種到MRS 液體培養基中，37 ℃200 r·min-1培養，每隔2 h 取樣1 次，測定600 nm處吸光度值及pH。繪制生長曲線和pH曲線。

1.5 抑菌性試驗

菌種活化后，1%接種量接種到100 mL MRS液體培養基中，37 ℃200 r·min-1充分振蕩48 h 即為所需菌液，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液用0.45 μm 濾膜過濾備用。調整大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌濃度吸光值約為0.05，測定600 nm 處吸光度。實驗組為4 mL 指示菌液加1 mL 實驗菌液，對照組為4 mL 指示菌液加1 mL 生理鹽水。37 ℃200 r·min-1充分振蕩共培養3 h，觀察菌體的渾濁情況。測定所有試管液體的600 nm 處吸光度值，計算抑菌率。

抑菌率（%）=[（A空-A空0）-（A樣-A樣0）]/（A空-A空0）×100%

1.6 耐抗生素試驗

采用的是K-B 紙片擴散法。活化菌種1%接種于MRS液體培養基中搖瓶震蕩培養48 h 后，調整試驗菌濃度為2×108cfu·mL-1，涂布平板。貼上藥敏紙片，正置于37 ℃恒溫培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.7 產酸能力鑒定

取5 mL 37 ℃培養過夜后的菌體發酵液，10 000 r·min-1離心5 min，用生理鹽水稀釋10倍即為待測液。設置空白組、標準品、測定組，分別加入0.02 mL雙蒸水、3 mmol·L-1標準品、待測樣本，各管均加入1 mL 酶工作液，0.2 mL 顯色劑，混勻，37 ℃水浴反應10 min 后，加入終止液1 mL ，混勻，測定各試管液體的530 nm 處吸光度值，雙蒸水調零。乳酸含量計算公式如下：

1.8 產酶能力鑒定

1.8.1 淀粉酶（AMS）

取5 mL 37 ℃培養過夜后菌體發酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。設置空白組、測定組，加入底物緩沖液0.5 mL，待測樣品0.1 mL，混勻，37 ℃水浴反應7.5 min 后，測定管加入3.0 mL，空白管加入3.1 mL，其余各管均加入0.5 mL碘應用液混勻，測定各試管液體的660 nm 處吸光度值，雙蒸水調零。淀粉酶活力計算公式如下：

1.8.2 蛋白酶

取5 mL 37 ℃培養過夜后的菌體發酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。設置樣品組和對照組，吸取400 μL 反應液至離心管中，樣品組加入100 μL 待測樣品，對照組加入100 μL 陰性液，混勻，37 ℃孵育30 min后，加入500 μL 終止液，渦旋震蕩5 s，冰槽里孵育15 min，4 ℃3 000 r·min-1離心15 min，吸取500 μL 上清液，加入500 μL 中和液，混勻，測定各組440 nm 處吸光度值，雙蒸水調零。蛋白酶活力計算公式如下：

1.8.3 乳糖酶

取5 mL 37 ℃培養過夜后的菌體發酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。設置空白組、標準品組、測定組、對照組，分別加入25 μL 雙蒸水、25 μL 5.55 mmol·L-1葡萄糖液、25 μL 待測樣品，各組均加入50 μL 底物，混勻，37 ℃孵育20 min，各管均加入25 μL終止液，對照管加入25 μL 待測樣品，混勻，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液40 μL加入1 mL顯色液，混勻，37 ℃孵育15 min，測定各組505 nm處吸光度值，雙蒸水調零。乳糖酶活力計算公式如下：

1.8.4 纖維素酶

取5 mL 37 ℃培養過夜后的菌體發酵液，10 000 r·min-1離心5 min，保留上清液用硫酸銨沉淀法粗提酶液。第1步是制作糖化液上清，設定測定管和對照管，分別加入50 μL 勻漿上清和煮沸勻漿上清，各組均加入50 μL 緩沖液、200 μL 底物和50 μL蒸餾水，混勻，37 ℃孵育30 min后，立即放入沸水中煮沸15 min，流水冷卻，4 000 r·min-1離心10 min，即為糖化液上清。第2 步是顯色反應，設置空白組、標準品組、測定組、對照組，分別加入50 μL 雙蒸水、50 μL 2 mg·mL-1葡萄糖標準液、50 μL 測定樣品、50 μL 對照樣品，各組均加入150 μL 顯色液，混勻，沸水浴15 min，流水冷卻，均加入1 mL 蒸餾水，混勻，測定各組550 nm處吸光度值，雙蒸水調零。

2 結 果

2.1 生理生化鑒定

對G4 菌株進行生理生化鑒定，結果見表1。由表1 可知，菌株明膠液化陰性，V-P 反應為陽性，55 ℃生長為陽性，其他結果詳見表1。上述結果與《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》中關于凝結芽孢桿菌的分析進行比較，初步鑒定為凝結芽孢桿菌[2-3]。

表1 菌株G4的生理生化特征

2.2 16S rDNA序列測定

對G4菌株進行16S rDNA測序后，分析比對所得序列與GenBank中的序列，并用Mega 6.0軟件構建系統發育樹（見圖1）。結果顯示該菌與NCBI 公布的凝結芽孢桿菌LA204 和DSM2314 的同源性達到100%，結合生理生化試驗結果，進一步將該分離菌鑒定為凝結芽孢桿菌。

2.3 生長曲線及pH曲線

由圖2 可知，G4 菌株在4 h 進入對數生長期，14 h進入平臺期，pH在24 h可達4.8左右。

圖1 凝結芽孢桿菌G4的16S rDNA系統發育樹

圖2 凝結芽孢桿菌G4生長曲線及pH曲線

2.4 抑菌能力

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，分析凝結芽孢桿菌的抑菌活性。G4 菌株對共培養的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別是91.0%和95.1%，均超過90%以上，具有一定程度的抑菌作用。

2.5 耐抗生素能力

凝結芽孢桿菌G4對抗生素的耐受能力見表2。

由表2 可知，大多數抗生素對凝結芽抱桿菌G4 都有較高的抑制能力，G4 只對桿菌肽是耐藥的，結果表明，臨床用藥中凝結芽胞桿菌G4 可以與桿菌肽同時使用，而不能與其他抗生素共用。

2.6 產酸能力

研究表明，凝結芽孢桿菌因其厭氧和較好抗逆性被作為工業生產乳酸的主要微生物之一。由表3 可知，與乳酸菌LP28 相比，G4 產酸量約為乳酸菌產酸量的50%，具備一定的產酸能力。

2.7 產酶能力

采用發酵液法對G4 菌株的胞外酶產酶活性進行測定。由表4 可知，菌株G4 產淀粉酶量最多，可達到213.99 U·mg-1prot，其次是乳糖酶酶活力是45.98 U·mg-1prot，蛋白酶量較少，纖維素酶未檢出。

表2 凝結芽孢桿菌G4對抗生素的耐受能力

表3 凝結芽孢桿菌G4的產酸能力

表4 凝結芽孢桿菌G4的產酶能力

3 討 論

近年來，凝結芽孢桿菌因其良好的抗逆性和益生特性成為飼料微生物添加劑的研究熱點。許多研究結果表明凝結芽孢桿菌具有多種生物特性，例如抗菌、調節腸道菌群平衡、抗炎、改善機體免疫功能、促進消化吸收和改善仔豬腹瀉等。Abada證明凝結芽孢桿菌具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌的作用[4]。Jensen GS 等報道凝結芽孢桿菌GanedenBC30?不僅具有抗炎的作用，在先天性免疫中也發揮重要的作用[5]。Sudha 等也證實凝結芽孢桿菌IS2 可以抑制炎癥因子IL-12、TN-α和IFN-γ的表達，還能抑制環氧化酶COX-2 的生成，從而抑制NF-κB P65 蛋白（Rel A）的表達[6]。Benson 等還發現凝結芽孢桿菌GanedenBC30TM代謝產物可以促進更多抗原遞呈細胞成熟，進而改善機體免疫功能[7]。Keller 等證明凝結芽孢桿菌GBI-30 可增加蛋白消化率，轉換更多的小肽和游離氨基酸，從而促進植物蛋白消化和吸收[8]。

通過對凝結芽孢桿菌G4 的益生特性研究，實驗結果表明該菌株具有較好的抑菌能力，對致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均在90%以上，菌種對大部分抗生素均高度敏感，在臨床用藥過程中不能同時使用。乳酸是凝結芽孢桿菌代謝的主要產物之一，G4菌株產乳酸量為48.05 mmol·L-1，凝結芽孢桿菌是工業產乳酸的理想微生物因其在厭氧條件和50 ℃以下可發酵葡萄糖和木糖產乳酸。凝結芽孢桿菌同時具備相應的產酶能力，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶等[9-12]。G4菌株產淀粉酶量最多，酶活力為213.99 U·mg-1prot，許多研究發現產淀粉酶所使用微生物最多的是凝結芽孢桿菌。G4 菌株產乳糖酶酶活力是45.98 U·mg-1prot，產蛋白酶較少酶活力為0.094 U·mg-1·min-1。綜上所述，凝結芽孢桿菌G4菌株具有良好的益生特性，為研制飼料微生態制劑提供菌種參考。