溶劑法提取牡丹籽粕中芍藥苷的工藝研究

高英莉，張惠喜，孫啟亮，肖 猛，宋紅衛(wèi)

（菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000）

油用牡丹籽為芍藥科芍藥屬鳳丹牡丹和紫斑牡丹所結(jié)種子，以其為原料用壓榨法制取的食用油脂即牡丹籽油[1]。研究發(fā)現(xiàn)牡丹籽油含有大量人體所必需的不飽和脂肪酸，尤其是亞麻酸占比達(dá)45%[2]，2011年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生與健康委員會(huì)將其批準(zhǔn)為新資源食品，使牡丹籽油優(yōu)良的食用價(jià)值得以凸顯。牡丹籽粕是油用牡丹籽經(jīng)預(yù)壓榨浸出或直接浸出榨取油脂后的物質(zhì)[3]，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富且成分比例合理[4-5]，可用于提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能[6]和毛皮質(zhì)量[7]，具有優(yōu)良的飼用價(jià)值；但牡丹籽粕中含有低聚芪類和單萜苷類等副產(chǎn)物，以芍藥苷含量最多[8]。一方面，副產(chǎn)物限制了牡丹籽粕在食品及飼料中的應(yīng)用，另一方面，廢棄處理不僅帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題，還會(huì)導(dǎo)致資源浪費(fèi)。將副產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)主要成分有效分離成了當(dāng)下需要解決的緊迫問(wèn)題。

本試驗(yàn)以乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間、超聲時(shí)間為研究因素，以芍藥苷提取量為響應(yīng)值，通過(guò)Design-expert軟件分析建立回歸模型，確定最佳提取方案，實(shí)現(xiàn)芍藥苷與牡丹籽粕固形物有效分離。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牡丹籽粕細(xì)粉，經(jīng)脫殼、粉碎、過(guò)80 目篩制得，購(gòu)自菏澤天寶牡丹生物科技有限公司；無(wú)水乙醇：優(yōu)級(jí)純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇：色譜純（德國(guó)默克）；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.8%（Stanford Analytical chemicals Inc.）；磷酸二氫鉀：分析純（西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（e2695）：waters；超聲波清洗器（KQ-500型）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱為XBridge C18， 5 μm， 4.6×250 mm；流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（40:65 V/V）；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品5.28 mg 至25 mL 棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備溶液。分別精密量取貯備溶液0.5、1、2.5、5、10 mL 置10 mL 棕色量瓶中并用甲醇定容至刻度即得標(biāo)曲系列工作液。

1.5 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將系列工作液分別注入液相色譜中，測(cè)定相應(yīng)峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.6 芍藥苷提取單因素試驗(yàn)

主要研究乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間、超聲時(shí)間對(duì)芍藥苷提取的影響。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化芍藥苷提取試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的條件基礎(chǔ)上，選取各因素最適宜的條件編碼為0，以提取液中芍藥苷含量為指標(biāo)，優(yōu)化各因素最佳組合作提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以芍藥苷含量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，建立回歸方程：y=2.64×104x＋5.75×103，R2=0.998968，滿足定量分析要求。

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)牡丹籽粕中芍藥苷提取的影響

精 密 稱 取1.0015、1.0221、1.0136、1.0023、1.0051、1.0213 g 牡丹籽粕細(xì)粉，按料液比1:20 分別于100%、90%、80%、70%、50%、10%乙醇溶液中浸提2 h，然后超聲20 min，精密量取上清液1～10 mL量瓶中并用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至刻度，用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。以乙醇濃度為橫坐標(biāo)（%），芍藥苷含量（mg·g-1）為縱坐標(biāo)繪制圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)芍藥苷提取的影響

由圖1可知當(dāng)乙醇濃度低于50%時(shí)，隨著乙醇濃度增加，芍藥苷提取量呈升高趨勢(shì)，在乙醇濃度達(dá)到50%后，芍藥苷提取量達(dá)到最高值，隨著乙醇濃度再次提高，芍藥苷提取量呈降低趨勢(shì)。因此選取乙醇濃度50%比較合適。

2.1.2 料液比對(duì)牡丹籽粕中芍藥苷含量的影響

準(zhǔn) 確 稱 取1.0073、1.0438、1.0154、1.0058、1.0123 g 牡丹籽粕細(xì)粉，分別按料液比1:3、1:5、1:10、1:20、1:30 加入50%乙醇，在室溫條件下浸提2 h，超聲20 min，同法稀釋、過(guò)濾、上機(jī)測(cè)定，測(cè)定不同料液比對(duì)芍藥苷提取量的影響，確定最佳料液比（見圖2）。

圖2 料液比對(duì)芍藥苷提取的影響

由圖2 可知，當(dāng)料液比<1:10 時(shí)，隨著料液比增加，芍藥苷含量逐漸提高，料液比達(dá)1:10 后，芍藥苷含量達(dá)最高值，再增加用液量，芍藥苷含量不再提高反而下降，確定1:10 的比例為最佳料液比。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)芍藥苷含量的影響

準(zhǔn) 確 稱 取1.0097、1.0938、1.0127、1.0083、1.0445 g牡丹籽粕粉，在料液比1:20、加入50%乙醇溶液，室溫條件分別浸提5、10、30、60、120 min，超聲20 min，同法稀釋、過(guò)濾、上機(jī)測(cè)定，測(cè)定不同浸提時(shí)間對(duì)芍藥苷提取量的影響，確定最佳浸提時(shí)間（見圖3）。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)芍藥苷提取的影響

由圖3可知，在浸提時(shí)間10 min內(nèi)，芍藥苷提取率與浸提時(shí)間呈正相關(guān)，在浸提時(shí)間達(dá)到10 min后，芍藥苷提取率不再升高，確定最佳浸提時(shí)間為10 min。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)芍藥苷含量的影響

準(zhǔn) 確 稱 取1.0044、1.0013、1.0102、1.0144、1.0070 g 牡丹籽粕粉，按料液比1:20、乙醇濃度50%、浸提2 h，室溫條件下，分別超聲5、10 、15、20 和25 min，測(cè)定不同超聲時(shí)間對(duì)芍藥苷提取量的影響，確定最佳超聲時(shí)間（見圖4）。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)芍藥苷提取的影響

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，芍藥苷含量并沒有線性規(guī)律的改變，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)芍藥苷的提取無(wú)明顯影響。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)選取的因素水平編碼見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-expert 對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果分析，得到芍藥苷含量（y）與A、B、C之間的二次多元回歸模型：y=33.368-0.95375A-1.22875B-0.42C+0.7025AB+0.215AC+0.345BC-1.34275A2-1.21275B2-1.04025C2。

該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果見表3。

由表3 可知，A、B、A2、B2、C2對(duì)芍藥苷提取影響極顯著（P<0.01）；C、AB影響顯著（P<0.05）。A、B、C三因素影響主次順序?yàn)锽＞A＞C。該模型P為0.00014（P<0.01），表明該回歸方程線性極顯著；失擬項(xiàng)P為0.5022（P>0.05），失擬不顯著，表明該回歸方程擬合程度良好。

表3 回歸方程的方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-expert分析，以芍藥苷最大提取率為優(yōu)化目標(biāo)，得到最佳提取條件為乙醇濃度35.6%、料液比1:20、浸提時(shí)間18 min；在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)芍藥苷提取率平均值為33.63 mg·g-1，與系統(tǒng)預(yù)估值33.92 mg·g-1基本一致。

3 討 論

油用牡丹籽含有大量有生物活性的單萜苷類物質(zhì)，且含量在不同地區(qū)間差異顯著，但芍藥苷含量在單萜苷中占比始終最高，可達(dá)50%以上[9]，可作為芍藥苷藥物提取原料[10]。其他單萜苷類物質(zhì)也以芍藥苷類似物居多[11]，且是單萜苷類主要活性成分[12]。所以本試驗(yàn)以芍藥苷為響應(yīng)值，能夠代表牡丹籽粕中單萜苷類物質(zhì)的提取水平。

牡丹籽粕顆粒經(jīng)粉碎后，內(nèi)部凝聚力被破壞，較粉碎前具有更好的溶解性且營(yíng)養(yǎng)成分保留良好[13]。如果粉碎后的牡丹籽粕可全部通過(guò)80 目篩，那么顆粒內(nèi)部凝聚力減弱，芍藥苷可快速溶于水，這可能是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的超聲時(shí)間對(duì)芍藥苷的提取影響不顯著的原因。這種特性也使牡丹籽粕可以灌胃的形式進(jìn)行毒理學(xué)研究[14]。

芍藥苷具有抗炎、護(hù)肝、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用[15]，水溶性良好。牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量豐富，且水溶性蛋白占比高達(dá)20.03%[16]，已發(fā)表文獻(xiàn)多用50%～70%（V/V）的乙醇溶液提取芍藥苷[17-20]，可能原因在于低醇溶液可溶解一部分蛋白質(zhì)，干擾芍藥苷純化，而70%（V/V）的乙醇溶液利于芍藥苷提取，蛋白溶解率低，雜質(zhì)含量少。

4 結(jié) 論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間對(duì)牡丹籽粕中芍藥苷的提取有顯著影響。在響應(yīng)面設(shè)計(jì)的優(yōu)化試驗(yàn)中，選取50%乙醇濃度、1:10 料液比、10 min 浸提時(shí)間為編碼水平中心點(diǎn)，將芍藥苷提取方案優(yōu)化為乙醇濃度35.6%、料液比1:20、浸提時(shí)間18 min，按此條件測(cè)定牡丹籽粕中芍藥苷含量為33.63 mg·g-1，證明此參數(shù)可行。